Poly-L-Lysine玻片在寡核苷酸芯片制备中的改进

目的为了制得适合固定未修饰寡核苷酸的芯片,提高检测灵敏性,对Patrick Brown 实验室的多聚左旋赖氨酸包被玻片的方法进行改进。方法玻片经清洗后用缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷进行硅烷化,然后应用Poly-L-Lysine在玻片表面形成聚合物涂层,经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化后可使寡核苷酸共价连接在芯片表面。设计了各种实验考察方法改进前后芯片表面的性能,并将改进后的玻片初步应用于SARS冠状病毒寡核苷酸芯片检测中。结果方法改进后芯片表面性能优良:固定效率高、点的同一性好、杂交效率和热稳定性好、寡核苷酸结合牢固、芯片可以重复利用。结论利用共价连接,方法改进后的芯片表面适合固定未修饰的寡核苷酸,解决了寡核苷酸与玻片之间物理结合不稳定、易剥离的缺陷,提高了芯片检测的灵敏性。     

Poly-L-Lysine玻片在寡核苷酸芯片制备中的改进

目的 为了制得适合固定未修饰寡核苷酸的芯片，提高检测灵敏性，对Patrick Brown实验室的多聚左旋赖氨酸包被玻片的方法进行改进。方法 玻片经清洗后用缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷进行硅烷化，然后应用Poly-L-Lysine在玻片表面形成聚合物涂层，经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化后可使寡核苷酸共价连接在芯片表面。设计了各种实验考察方法改进前后芯片表面的性能，并将改进后的玻片初步应用于SARS冠状病毒寡核苷酸芯片检测中。结果 方法改进后芯片表面性能优良：固定效率高、点的同一性好、杂交效率和热稳定性好、寡核苷酸结合牢固、芯片可以重复利用。结论 利用共价连接，方法改进后的芯片表面适合固定未修饰的寡核苷酸，解决了寡核苷酸与玻片之间物理结合不稳定、易剥离的缺陷，提高了芯片检测的灵敏性。     

表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响

目的:探索纤维蛋白(fibrin,FB)修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)支架材料上成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)黏附、增殖及分化的情况。方法:实验分为两组:实验组,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);对照组,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC)。将SD大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞,种植于支架材料上,体外复合培养。通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3,7,10,14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶表达量以及扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异。结果:大鼠MSCs经诱导培养14 d后,I型胶原免疫荧光染色为阳性;实验组支架材料的细胞黏附率显著高于对照组(P<0.05);且相同时间点实验组支架材料中的细胞数及碱性磷酸酶表达量也明显高于对照组(P<0.05);电镜观察发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。结论:表面修饰纤维蛋白后的nHAC支架材料具有更好的细胞黏附、增殖及促成骨分化能力。     

血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力影响机制研究

目的 探讨血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响机制.方法 分别用MTT法、流式细胞仪、细胞划痕实验、Transwell小室检测血根碱作用后的宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力.Western blot检测经血根碱作用后宫颈癌细胞中E-Cadherin、PTEN、β-catenin、MMP2的蛋白表达水平.结果 0.6、0.8μmol/L血根碱对宫颈癌细胞增殖具有抑制作用.0.8 μmol/L血根碱作用48 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha凋亡率高达(45.68±2.26)％和(31.89±3.80)％.0.8μmol/L血根碱作用3 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha黏附率仅有(67.45士2.13)％和(73.59±2.61)％.0.8μmol/L血根碱作用16 h后宫颈癌细胞HeLa和Siha侵袭数目仅有(39.64±1.98)个和(43.87±2.83)个.经血根碱作用后的宫颈癌细胞中E-Cadherin和PTEN的表达量增加,β-catenin和MMP2的表达量减弱.结论 血根碱对宫颈癌细胞具有抑制增殖及促凋亡作用,其机制可能与黏附蛋白E-Cadherin、β-eatenin和PTEN、MMP2有关.     

硅酸修饰的抗体微阵列玻片对红细胞的血型抗体吸附能力的研究

目的探讨用硅酸修饰的微阵列玻璃基片,对红细胞血型抗体的吸附能力.方法将玻片用硅酸钠溶液处理,经酸化以形成硅酸,然后用抗红细胞血型抗体(抗-A、抗-B、抗-AB、抗-D)包被,以对应红细胞作反应指示物,以检测经硅酸修饰后的玻片对红细胞血型抗体的吸附能力,以及血型抗体的免疫活性.结果抗红细胞血型抗体可以牢固的结合在硅酸修饰过的玻片上,并且可以与其对应的红细胞抗原进行免疫学反应.结论经硅酸修饰的玻片对血型抗体有很高的结合效力,同时抗体仍保持很高的免疫活性,因而可进一步充当蛋白质抗体微阵列基片.     

舌鳞癌切片的原子力显微镜纳米操纵研究

目的 利用原子力显微镜（AFM）进行人舌鳞癌组织和细胞切片原位纳米尺度的操纵,并发展样品制备及处理的方法,提高舌鳞癌切片AFM图像的反差和分辨率,以满足纳米定位、切割、分离和拾取等一系列操纵的需求。方法人舌鳞癌组织和培养细胞按常规的电镜超薄切片法和石蜡切片法制样后,将切片分别转移至云母表面或载玻片表面,在空气中以接触模式AFM观察。选择合适的针尖并控制力的大小和扫描范围,进行纳米级成像、定位、分离和拾取等操纵。结果选择合适厚度的超薄切片,AFM观察显示,细胞轮廓清晰,细胞膜、核膜等结构明显,核内可见核仁,围绕核膜有颗粒状的细胞器。双氧水和二甲苯处理切片提高反差及AFM成像质量。对石蜡切片能分辨细胞轮廓、核内结构以及细胞间的结构。经上述处理的舌癌切片,通过控制扫描方向和针尖力的大小,实现了范围在20nm～1μm之间的操纵,并利用针尖获取核内遗传物质。结论以人舌鳞癌组织和细胞切片AFM高分辨率成像和结构分辨为基础,实现了AFM原位纳米尺度的操纵,获得特定细胞核内部的遗传物质,进一步开展生化分析,用于肿瘤早期诊断。     

自制爬片装置用于细胞爬片及细胞染色

目的利用自制爬片装置改进细胞爬片的制备方法。方法通过自制装置和传统方法制备细胞爬片,苏木精- 伊红染色法（HE 染色）观察细胞生长状态,比较两种细胞爬片制备方法的差异;利用自制装置制备同时给予3 种不同干预处理的细胞爬片,验证其应用于制备多干预条件细胞爬片;制备同时含有3 种不同细胞的集成爬片,验证其用于制作细胞集成爬片的应用。结果自制装置可简化细胞爬片流程,细胞直接贴于载玻片上生长,未出现污染和增殖受限,制作多干预或多种细胞集成爬片效果明确,无相互干扰现象。结论自制装置能更简便地制备以满足普通染色及特殊染色实验要求的细胞爬片,是一种更好的制备细胞爬片的方法。     

IL-10基因修饰树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受的诱导

目的:探讨白介素10(IL-10)修饰的供体树突状细胞(dendriticcells,DC)对大鼠同种异体皮肤移植术后免疫耐受的诱导效果,为该基因治疗方法在皮肤移植的临床应用提供依据。方法:供体DC以humanIL-10基因修饰后,通过外周静脉输入受体体内,一周后行大鼠同种异体皮肤移植,根据实验分组观察受体移植皮肤存活情况。结果:对照组、未修饰DC组、hIL-10修饰DC组大鼠移植皮肤存活时间分别为(6.86±1.34)d、(7.57±2.45)d、(13.71±4.04)d,经统计学处理,未修饰DC组与对照组之间无显著性差异,而hIL-10修饰DC组与对照组之间有显著性差异(P<0.01)。结论:hIL-10修饰的供体DC预处理受体,可明显延长移植皮肤存活时间。     

液基薄层细胞学筛查门诊人群宫颈癌的研究

目的探讨TCT技术和TBS方案对妇科门诊人群子宫颈癌筛查的准确性.方法随机收集妇产科门诊人群5 000例宫颈脱落细胞液基标本,采用TCT技术和TBS方案诊断.对细胞学阳性的即意义不明的不典型鳞状/腺细胞(ASCUS/AGUS)以上病变200例病例行阴道镜活检和组织病理学诊断.所有诊断均双盲进行.结果 TCT细胞学检出100%(9/9)的鳞状细胞癌(SCC),1例腺癌(AC),检出95%(38/40)的鳞状上皮内高度病变(HSIL),70.77%(92/130)的鳞状上皮内低度病变(LSIL).经统计学处理,液基细胞学对HSIL及SCC诊断与活检组织病理诊断的符合率显著高于对LSIL的诊断符合率(P＜0.01),两者差异有显著性.结论生育年龄段的妇女应定期进行液基细胞学筛查,TCT技术和TBS方案对宫颈上皮内病变,尤其是HSIL及其以上病变的筛查敏感性高.     

In vitro effect of biologically active coating on endothelialisation of Nitinol coils designed for the closure of intracardiac shunt

To evaluate in vitro the effect of biologically active coating on endothelialisation of Nitinol coils designed for the dosure of intracardiac shunt. Methods: Covalently binding procedure was performed with chemical vapor deposition (CVD).Heparin(200 IU/ml),r-hirudin(21 nmol/ml),or fibronectin(15 μg/ml),respectively, were bound to the basic coating(poly( amino-p-xyly-lene-co-p-xylylen) ). In vitro tests were performed on five different coating groups(n=2 each):uncoated Nitinol, basic coating,heparin-,r-hirudin-,and fibronectin-coating. Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were cultured in the presence of tested coils for 48 and 72 h. Adhesion of HUVECs were evaluated with light microscopy,and with confocal laser scanning microscopy after double-staining of vinculin, phalloidin, Ki67 and fibronectin. Results: After 48 and 72 h of incubation, except HUVECs around the basic coating showing ab-normal morphology, HUVECs were able to grow next to all kinds of coils. By CLSM adhering cells were typically confined to maximal three secondary coil windings. HUVECs adhered best to the fibronectin coated coils, followed by the uncoated Nitinol. HUVECs barely adhered to the basic coating. The adhesion to heparin coating or r-hirudin coating was observed with various cell densities. Heparin coating seemed to support cell adhesion better than r-hirudin coating did. The HUVECs assembled fibronectin matrix on the fibronectin coating and Nitinol coil. Vinculin was expressed on both fibronectin coating and uncoated Nitinol as well, mostly diffused, but occasionally also in focal contacts. Ki67 expression was mainly noticed on the uncoated Nifinol coil and fibronectin coated coil, only occasionally on other materials. The densities and morphology of HUVECs, adhered to the correspohding well surfaces, were similar for all wells. The only exception was the well with the basic coating coil after three days of incubation. In this case, the cell density was diminished,and the cells became more elongated. The cells grown on the well surfaces exhibited a more profound matrix assembly and more pronounced focal adhesions than the cells adhered to the coil surfaces did. Condusion: Except for basic coating,biologically active substance coated or uncoated coils show no acute cytotoxicity on HUVECs. Due to better cell proliferation,cell matrix assembling,and focal adhesion,only fibronectin coating improves the endothelialisation of Nitinol coils。     

RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附性影响的研究

目的了解精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD多肽)修饰是否能提高改性的PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。方法用异型双功能交联剂SulfoLCSPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,以未接多肽的改性PLGA材料做对照,取第三代MSC接种到材料上,培养4、12小时后沉淀法定量检测粘附的细胞数,培养24小时后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态。结果培养4、12小时后实验组细胞粘附率分别为0.17±0.01、0.38±0.02,均极显著高于对照组的0.08±0.01、0.14±0.01(P<0.01),且24小时后细胞的粘附质量也较对照组为好。结论RGD多肽修饰的确能提高改性PLGA支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。     

显微镜下颈前路经颈椎间隙减压的手术技巧

[摘要]目的探讨显微镜下经椎间隙颈前路减压技术,总结手术技巧。方法2000年6月至2005年12月间于显微镜下共行颈前路经椎间隙减压术271例,均为颈椎间盘突出患者,其中单间隙178例、双间隙71例、三间隙22例。所有患者影像显示脊髓前方压迫、压迫程度轻到中度及轻度髓内改变。主要设备为脊柱外科专用手术显微镜和高速磨钻。高速磨钻磨除纤维环和部分椎体后壁,显露清理变性髓核,钩形剥离子提起后纵韧带后切断,再切除残余的后纵韧带及椎体后缘骨赘。结果271例手术无脊髓、神经、血管损伤并发症。手术时间(62±12.4) min,失血 (126±29.4) ml,下地时间为术后(1.8±0.4) d。所有患者术后神经功能均有不同程度改善,功能改善率优69例,良157例,中27例,差18例。结论经椎间隙减压适用于椎间隙平面的病变,显微镜下精细操作及高速磨钻有利于手术成功,术后椎间隙结构更符合颈椎生物力学特性。     

ThinPrep液基细胞学在宫颈癌筛查中的临床应用

目的:评价ThinPrep液基细胞学对宫颈癌筛查的临床价值.方法:ThinPrep液基细胞学检测了769例妇科病例,同时做宫颈巴氏涂片检测.细胞学诊断采用TBS分级系统,阳性诊断包括意义不明的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)以上的病变,诊断结果与阴道镜下多点组织活检病理结果相对照.结果:ThinPrep液基细胞学检测的敏感性、准确性分别为87.1%、97.3%,而宫颈巴氏细胞学检测的敏感性、准确性分别为68.1%、93.2%,两种方法比较均有显著性差异(P＜0.01).结论:ThinPrep液基细胞学应用于宫颈癌筛查能明显提高宫颈异常细胞诊断的敏感性及准确性,有利于宫颈癌筛查的早期诊断.     

长爪沙鼠发情周期规律与判定方法

目的 研究长爪沙鼠发情周期,揭示发情规律,优化判定方法。方法 连续18 d采集50只长爪沙鼠阴道上皮脱落细胞涂片,采用角化细胞计数法研究长爪沙鼠发情周期规律。比较瑞氏染色、HE染色和直接镜检判定发情周期4个时相的优缺点。结果 长爪沙鼠的发情周期有稳定型、不稳定型、假孕三种类型。其中稳定型占68.6%,发情周期为（106.3±35.0）h,可分为4个时相。4个时相角化细胞的比例分别为发情前期（13.5±7.8）%、发情期（86.7±9.9）%、发情后期（27.9±12.8）% 和发情间期（3.3±2.8）%。结论 角化细胞计数能准确地判定长爪沙鼠的发情周期及各个时相。直接镜检法能快速反映阴道脱落细胞的形态。     

改性聚乳酸与Schwann细胞的生物相容性研究

目的:对不同的改性聚乳酸材料进行Schwann细胞(SC)生物相容性观察。方法:采用细胞增殖度法,观察不同材料浸提液对SC增殖影响,进行毒性评级;采用相差显微镜、扫描电镜、荧光分光光度法观察细胞形态以及黏附情况。结果:除2#材料(PLA-g-HEMH)的高浓度浸提液毒级为2级外,其余毒级均为0~1级,细胞生长良好,其黏附性较未改性聚乳酸高,但所有材料SC的黏附性仍低于培养板(P<0.01)。结论:改性后的材料细胞生物相容性良好,其表面亲水性增加,但2#材料可能在改性过程中表面酸度增加,在处理上有必要改进。     

肝癌细胞在Ⅳ型胶原裱衬表面的粘附特性

定量描述肝癌细胞和肝细胞在Ⅳ型胶原裱衬表面的粘附特性,探讨细胞粘附力与Ⅳ型胶原裱衬浓度及Ⅳ型胶原与层粘连蛋白复裱衬时ＬＮ复合浓度的相关关系。方法采用分步裱衬的方法制作 有关裱衬表面,即依次在玻璃表面裱衬多聚赖氨酸和Ⅳ型胶原／ＬＮ,最后以牛血清白蛋白作用阻断非特异性粘附。细胞粘附力采用微管吸吮技术进行测定。     

不同基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响

目的比较几种不同培养基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响,探讨兔气管纤毛上皮细胞体外培养最佳生长基质。方法用组织块法比较兔气管纤毛上皮细胞分别在新鲜配制鼠尾胶原、市售鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶4种基质上的贴壁和生长状况。结果兔气管黏膜上皮组织在4种基质上的贴壁率分别为:新鲜配制胶原89.1%,市售胶原43.5%,多聚赖氨酸36.9%,明胶21.7%;贴壁组织的单细胞层最大生长半径分别为:新鲜配制胶原(1 432.2±383.2)μm,市售胶原(928.9±390.3)μm,多聚赖氨酸(889±229.2)μm,明胶(651±221.2)μm;纤毛摆动最大频率及持续时间分别为:新鲜配制胶原(10.0±1.5)Hz 11 d,市售胶原(8.5±0.6)Hz 5 d,多聚赖氨酸(8.9±0.5)Hz 3 d,明胶(5.9±0.3)Hz 2 d。扫描电镜下新鲜配制鼠尾胶原纤维成条索状,相互交织成网,利于组织贴壁和细胞生长。结论在常用的4种培养基质中,新鲜配制的鼠尾胶原是兔气管纤毛上皮细胞体外培养的最佳生长基质,是纤毛功能研究的可靠保证。     

超顺磁性氧化铁(SPIO)与多聚赖氨酸(PLL)纳米粒的制备、结构验证及其空间结构表征

 目的  探讨葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁(super-paramagnetic iron oxide,SPIO)与多聚赖氨酸(polylysine,PLL)纳米粒的制备及其结构验证和空间结构表征。方法  在共沉淀法制备葡聚糖修饰的SPIO基础上,加入PLL制备出一种新的SPIO-PLL纳米粒,利用粒度电位分析仪、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)对SPIO-PLL的粒径、电位、形貌学进行检测;高效液相凝胶色谱法(gel permeation chromatography,GPC)、红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)及核磁共振氢谱法(1HNMR)对SPIO PLL连接成功与否进行验证;高精度的原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)对SPIO-PLL的结构、形态及连接状态进行空间结构表征。结果  粒度电位分析和TEM结果显示SPIO-PLL的平均粒径为7.37 nm,平均电位为13.6 mV;GPC、FTIR及1HNMR结果显示SPIO及PLL之间已经成功连接;高精度AFM清楚显示出SPIO与PLL之间以亚胺键形式稳定相连。 结论  成功制备出一种性质稳定、粒径较小的新型SPIO-PLL纳米粒,这将对随后的肿瘤特异性探针制备奠定一定的基础。     

颈前路经椎间隙后缘截骨治疗退变性僵硬型颈椎后凸畸形

目的 总结颈前路经椎间隙后缘截骨（anterior trans-intervertebral osteotomy,ATIVO）技术治疗退变性僵硬型颈椎后凸畸形的治疗策略、方法及临床疗效。方法 回顾性分析2012年至2016年共47例因退变性僵硬型颈椎后凸畸形采用ATIVO技术进行畸形矫形的病例。其中,男性29例,女性18,年龄38~73岁。共83节段进行颈前路经椎间隙后缘截骨（C3/4 16例;C4/5 24例;C5/6 25例;C6/7 16例;C7/T1 2例）。单节段17例,双节段24例（跳跃节段6例）,3节段6例。经颈前路经椎间隙进行截骨,切除椎间盘及后纵韧带,两侧切除部分钩椎关节并进行松解,椎体后缘截骨面潜行约10°~15°,至少保留2/3终板。术中使用椎间撑开器、带角度椎间融合器、调整颈下软枕及改变颈后伸角度等综合方式进行后凸畸形矫形。融合方式采用填充人工骨颗粒的椎间融合器,固定方式采用自锁式椎间融合器或前路钛板。应用脊柱显微镜、脊柱骨动力系统（气动磨钻）进行截骨操作。应用皮节体感诱发电位、运动诱发电位、自由肌电进行联合功能监测。手术前后通过X线、CT进行影像学评估C2-C7 Cobb角、颈椎矢状面垂直轴（cervical sagittal vertical axis,cSVA）及截骨效果。使用疼痛视觉模拟评分（Visual Analogue Score,VAS）,颈椎功能障碍指数（Neck Disability Index,NDI）,日本骨科协会改良颈椎评分（modified Japanese Orthopaedic Association Score,mJOA）对临床疗效进行评价。结果 47例患者均获得最少1年随访,平均随访时间20个月（12个月至5年）。平均手术时间109 min （55~140 min）、出血量46 mL （25~110 mL）。术后3例患者出现肩部疼痛,5例患者出现C5神经根麻痹症状,无椎动脉损伤病例。末次随访时VAS、NDI、mJOA分别由术前7.2±1.5、64.5±17.4、10.5±0.9改善至2.6±1.7、34.8±21.6、14.5±1.3。CT显示截骨节段均获融合。C2-C7 Cobb角由13.6°±5.1°改变为-7.4°±3.6°;截骨节段矫形能力7.4°（5.3°~9.6°）/节段;C2-C7矢状面垂直轴由（55.7±13.8） mm改变为（31.4±8.2） mm。结论 采用颈前路经椎间隙后缘截骨技术治疗退变性僵硬性后凸畸形可获得良好的疗效,可显著纠正颈椎后凸畸形,纠正整体颈椎曲度,并阻止颈椎向前的矢状位失平衡趋势。该截骨技术骨量损失小,不影响椎间融合率,可多节段联合应用提高矫形效果。适用于由椎间盘、钩椎关节等原因导致的颈椎僵硬性后凸畸形。     

lncRNA HOTAIR在宫颈癌组织及HeLa细胞中的表达及其生物学功能研究

目的 探讨长链非编码RNA HOTAIR在宫颈癌组织中的表达及其生物学功能.方法 选取简阳市人民医院2014年8月至2016年7月收治并手术治疗的宫颈癌患者47例,采用实时荧光定量PCR检测患者癌组织及癌旁正常宫颈组织中HOTAIR RNA的相对表达量;以人宫颈癌Hela细胞为研究材料,应用小RNA干扰技术下调宫颈癌Hela癌细胞HOTAIR RNA表达,分别应用CCK-8实验、Wound Healing实验检测小干扰RNA下调HOTAIR表达前后Hela细胞增殖和迁移能力变化情况.结果 HOTAIR在宫颈癌患者癌组织与癌旁正常宫颈组织中的相对表达量分别为(6.89±2.12)与(4.02±1.89),癌组织显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组细胞相比,外源性小干扰RNA可显著敲低Hela细胞中HOTAIR的表达并影响其增殖和迁移(P<0.05).结论 宫颈癌患者癌组织中HOTAIR表达水平高于癌旁正常宫颈上皮;HOTAIR可能参与了宫颈癌细胞增殖和迁移等生物学功能.