小鼠PD-1胞外段的克隆、原核表达及活性分析

目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴...     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

GST-hSesn2融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-h Sesn 2融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hSesn2基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hSesn2,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒GST-h Sesn2,并用Western blot方法证实了GST-h Sesn2融合蛋白在原核细胞大肠埃希菌中阳性表达。结论 GST-h Sesn2原核表达载体成功构建为进一步纯化Sesn2及研究其结构与功能提供了前提基础。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

Tat融合蛋白表达载体TAT-SOX2的克隆化及蛋白表达研究

目的 构建重组表达载体TAT-SOX2,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人SOX2的全基因序列,连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-SOX2,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-SOX2融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-SOX2融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.     

人组织激肽释放酶6的原核表达载体的构建及表达

目的：构建人组织激肽释放酶6原核表达系统。方法：采用RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出KLK6基因片段,克隆至原核表达载体pET28b中,经酶切和序列测定后,转化至E.coli BL21,IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,Ni-NTA亲和层析柱纯化,其纯化产物进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：pET28b-KLK6原核表达载体构建成功,经IPTG诱导高效表达hK6蛋白,纯化后获得大量高纯度蛋白。结论：成功构建了KLK6的原核表达系统并在E.coli BL21中高效表达,获得高纯度的hK6融合蛋白。     

白斑综合症病毒极早期蛋白IE3的原核表达、纯化和鉴定

目的:构建对虾白斑综合症的极早期基因IE3的原核表达载体,制备纯化重组蛋白IE3。方法:以感染白斑综合症病毒的对虾心脏组织为模板,PCR法扩增极早期基因IE3基因的编码序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-4T-2-IE3。质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-IE3融合蛋白,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:PCR产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是IE3,DNA序列测定进一步证实与GenBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-IE3,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约33000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2-IE3,并表达出重组蛋白GST-3。为进一步研究对虾白斑综合症的防治提供了平台。     

DOC-1R基因表达载体的构建及其重组蛋白的表达纯化

目的 构建DOC-1R(deleted in oral cancer-1 related)的原核表达载体并且纯化其重组蛋白,用于进一步研究DOC-1R蛋白的结构与功能.方法 采用基因重组技术构建原核表达载体pGEX-DOC-1R,经DNA测序鉴定后,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达并纯化融合蛋白.结果 以菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定得到候选阳性克隆,测序结果表明所得到的克隆序列及开放阅读框架完全正确,IPTG诱导后SDS-PAGE电泳分析表明在40 kD处出现特征蛋白表达带,经磁珠亲合层析后Western印迹检测证实得到较高纯度的GST-p14DOC-1R融合蛋白.结论 成功构建了pGEX-DOC-1R的原核表达载体,表达并纯化出GST-p14DOC-1R融合蛋白,为DOC-1R抗体制备及研究DOC-1R蛋白结合蛋白及其在细胞周期调控中的生物学功能奠定了基础.     

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化

目的:探讨人FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白的原核表达纯化及其在体外与IgG的结合活性。方法:PCR方法从人的外周血白细胞中扩增出huFcγRⅠORF区全长基因并与T载体链接,从克隆载体huFcγRⅠ-T中扩增huFcγRⅠ胞外区基因,并将其装入原核表达载体pGEX-6p-1。构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:扩增到了huFcγRⅠ的胞外区基因,所构建的pGEXhuFcγRⅠ重组质粒经PCR和酶切鉴定与预期一致。IPTG诱导下目的蛋白的表达率约为30%。SDS-PAGE结果显示表达的目的相对分子质量(Mr)56 700与理论预期值一致。West-ern blot结果显示原核表达的huFcγRⅠ胞外区蛋白与人IgG特异亲和。结论:FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白在原核表达系统中得到有效的表达,复性蛋白在体外与人的IgG特异结合。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

Modes of Inheritance of Errors of Refraction

Eighteen families in which both parents had refractions within the range of +4·0 D to −4·0 D and axial lengths seen in emmetropia (22·3-26·0 mm) showed coefficients of correlation of the order 0·5 indicative of polygenic inheritance. Such coefficients were seen for axial length (0·407) and for the cornea (0·487), but not for the lens (which is known to be yoked to the axial length). No such coefficients were seen in 19 families in which one of the parents had axial length outside the emmetropic range (nine families with long axes and 10 with short axes).

The pattern of polygenic inheritance for emmetropia (completely correlated optical components) and errors of refraction up to 4·0 D (inadequately correlated components: correlation ametropia) follows that seen in stature and other measurable characters. In contrast the high refractive errors with their abnormal axial lengths (component ametropia) are—like the extremes in stature—pathological anomalies with monofactorial inheritance.