人脐血MSCs的分离培养及向神经的诱导分化

目的探讨人脐血中分离所得到间充质干细胞（MSCs）向神经组织细胞诱导分化的实验条件。方法淋巴细胞分离液分离正常人脐血单个核细胞,利用差速消化法通过多次传代得到MSCs,流式细胞仪测定细胞表型。取2至4代的MSCs加入含有维甲酸（RA）与神经生长因子（NGF）的诱导分化培养基将其定向诱导,免疫细胞化学染色检测诱导后的MSCs神经元和神经胶质细胞标志的表达。结果脐血MSCs每传一代,细胞数量增加约2～3倍。流式细胞仪检测,脐血MSCs不表达CD34,表达CD25、CD29、CD105、CD106。诱导后的细胞不仅形态类似神经元和神经胶质细胞,而且表达神经丝蛋白200（NF）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。结论从人脐血中可以分离得到与骨髓相似的MSCs,并且能够在体外分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞。     

人脐带血间充质干细胞条件培养基的制备及其生物学特性

目的探讨人脐带血(human umbilical cord blood,hUCB)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)条件培养基(conditionedmedium,CM)的制备方法,并分析MSCs的旁分泌作用。方法无菌条件下收集足月健康新生儿的脐带血,经肝素抗凝,离心后分离、培养、传代hUCB-MSCs,用倒置显微镜观察不同时期细胞的生长情况和形态特征,并用酶标仪检测细胞增殖情况,待细胞融合达80%时更换培养基,再继续培养24h后收集培养上清液即为人脐带血间充质干细胞条件培养基(hUCB-MSCs-CM)。结果经过传代后,人脐带血间充质干细胞形态趋于均一,为梭形或成纤维样、体积较大、单个核,呈漩涡样生长,且增殖能力较强,能较好的制备出其条件培养基。结论能通过此方法成功制备人脐带血间充质干细胞条件培养基,其中含有MSCs旁分泌的各种生物活性因子,可以作为一种新的治疗来源应用于临床。     

脐带血血清培养体系扩增脐带间充质干细胞及其生物学特征的实验研究

目的:通过观察以人脐带血血清为主体的培养体系对脐带间充质干细胞(Mesncllymal stem Ce]ls,MSCs)体外培养扩增的影响,探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性.建立从足月脐带分离间充质干细胞和体外传代培养技术,并对其生物学特性进行研究.方法:采用双酶法分离脐带间充质干细胞.并通过传代进行纯化和扩增培养.绘制生长曲线:用流式细胞仪检测脐带表面抗原及细胞周期.结果:成功建立了以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法:流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表CD44、CD29,低表达CD106,不表达追血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31,也不表达HLADR:细胞倍增时间为30h,细胞周期分析表明,G0-G1期和+C2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞.培养的细胞具有阃充质干细胞的基本特性.为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据.     

脐血间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者细胞因子分泌的影响

目的：体外探讨脐血间充质干细胞（UCB－MSCs）对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMNCs）细胞因子分泌的影响。方法①UCB－MSCs的分离、扩增及鉴定；②健康志愿者及SLE患者PBMNCs的分离。③UCB－MSCs与植物凝集素（ PHA）刺激的PBMNCs共培养， ELISA法检测共培养前后各组细胞培养上清液中IL－6、IL－10、IL－2、IL－12、IFN－γ的含量。结果①UCB－MSCs呈梭形贴壁生长，能在体外连续传代，均表达CD13、CD44、CD166，不表达 CD34、CD45；②UCB－MSCs能显著下调 SLE患者 PBMNCs中 IL－10、IL－6的分泌而上调 IL－2、IL－12、IFN－γ的分泌。结论 UCB－MSCs在体外能改变SLE患者的Th1／Th2极化状态。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同培养基对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）生物学特性的影响,优化培养方法。方法采用贴壁法从正常足月胎儿脐带中分离出间充质干细胞,细胞贴壁后利用DMEM/F12,Mesen PRORSTM Medium这两种培养体系进行体外扩增,绘制生长曲线,流式细胞仪检测其表面标志。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结论加入Mesen PRORSTM Medium培养的细胞增殖速度快,更适合于脐带间充质干细胞的体外扩增。     

脐带间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察在低浓度血清培养下脐带间充质干细胞（UC—MSCs）对脐血单个核细胞（MNC）的增殖和凋亡的影响。方法：利用密度梯度法分离脐血单个核细胞，接种于脐带MSC建立的饲养层培养，通过计数细胞、半固体培养和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡，以评价脐带MSC的支持造血功能和抗凋亡作用。结果：脐带间充质干细胞组单个核细胞总数及集落形成细胞（CFC）显著高于单培养组（P〈0．01），且单个核细胞凋亡率低于单培养组（P〈0．01）。结论：体外证实脐带MSC具有促进造血和抗凋亡作用。     

人脐血间充质干/祖细胞诱导为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血间充质干细胞用于神经细胞再生的可行性与人脐血间充质干/祖细胞最佳的诱导培养条件。寻找一种合适的细胞来源进行移植以代替受损的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞来修复神经损伤。方法将脐血单个核细胞置于低血清(2%)达氏修正依氏培养基中培养,生成贴壁细胞层,依传代方法,用相同培养条件进行扩增,扩增后的贴壁细胞置入细胞培养液(加入新生大鼠神经细胞分离培养上清液)中,并添加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行诱导分化。采用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测被诱导的神经样细胞的表面标志及细胞特异性标志、结构,并进行分析。结果脐血间充质干/祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为0.5×10-6,在传20代时,可有效扩增1.5×106倍,诱导后,70%的脐血间充质干/祖细胞分化为神经样细胞。结论采用上述扩增与诱导条件,脐血间充质干/祖细胞可得到有效扩增,并可高效向神经样细胞分化,从而证实脐血是一种细胞替代治疗前景光明的细胞来源。     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

糖基化终末产物调节氧化应激影响脐血间充质干细胞增殖及普罗布考保护作用

目的探讨糖基化终末产物(AGEs)对人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)增殖的影响及普罗布考的保护作用。方法体外分离培养脐血MSCs,应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD45、CD105进行表型鉴定。将MSCs分为白蛋白(BSA)对照组、糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)浓度效应组和普罗布考干预组。应用WST法检测各组细胞增殖情况。应用二氯醋酸荧光素探针和氧化应激检测试剂盒检测各组细胞活性氧(ROS)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量。结果流式细胞鉴定显示,脐血MSCs不表达CD34、CD45,表达CD105。与对照组相比,AGE-BSA组增殖能力下降,ROS含量增加,SOD和GSH-Px活性下降。与AGE-BSA组相比,普罗布考在10、20、50、100μmol/L范围内促进细胞增殖,降低细胞ROS含量,增加SOD和GSH-Px活性。结论 AGEs能够调节氧化应激,抑制脐血MSCs增殖。普罗布考的作用机制可能是通过抑制ROS生成和提高抗氧化酶活性来保护脐血MSCs增殖能力。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

体外定向诱导脐血间充质干细胞向类肝细胞分化的研究

目的 探讨诱导人脐血间充质干细胞（UBCMSCs）向类肝细胞定向分化的可能性。方法 采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合，从人脐血中分离UBCMSCs；通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44，确定UCBMSCs的比例。在UCBMSCs培养体系中，加入人肝细胞株L-02细胞培养上清液或诱导因子（联用HGF和FGF-4）共培养，检测诱导后第7天、14天细胞内细胞角蛋白18（CK18）、白蛋白及糖原的表达。结果 从脐血中分离获得均一贴壁的UBCMSCs；在UBCMSCs培养体系中，无论是添加L-02细胞培养上清液，还是采用诱导因子HGF和FGF-4，均可诱导UCBMSCs细胞内表达中晚期成熟肝细胞表面标志物CK8＆18、白蛋白及糖原。结论 密度梯度离心法和直接贴壁法相结合能够有效分离UCBMSCs；L-02人肝细胞培养上清液或诱导因子HGF、FGF-4均具有诱导UCBMSCs向类肝细胞定向分化的作用。     

脐血浆培养的脐血树突状细胞对胃癌细胞的特异杀伤作用

目的尝试用脐血浆代替胎牛血清培养脐血树突状细胞（DCs）,并使之负载胃癌抗原,观察其对胃癌细胞的特异杀伤作用。方法分离脐血单个核细胞（CBMCs）并在含10％同源脐血浆的培养体系中诱导培养,部分细胞加入胃癌冻融抗原冲击。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD1a和CD83表达,MTT法检测DCs体外刺激淋巴细胞增殖活性,LDH法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对胃癌及肝癌细胞的细胞毒作用。结果CBMCs能分化为表型正常的未成熟DCs,并进而吞噬胃癌细胞冻融抗原成熟,刺激淋巴细胞增殖并诱导对胃癌细胞株特异的CTLs毒性。结论脐血浆培养的脐血DCs能有效捕获胃癌冻融抗原,激发针对胃癌细胞的特异杀伤效应。本实验采用的DCs制备方法具有方法简单、成本较低、瘤苗制备时间较短等优点。     

人脐血CD34^ 内皮祖细胞的体外分化

目的：研究人脐血CD34^ 细胞群体中内皮祖细胞在体外分化为内皮细胞的过程中,干细胞标志以及内皮细胞表型随时间的变化。方法：将免疫磁珠细胞分选法（MACS）得到的CD34^ 细胞体外培养于纤连蛋白和无纤连蛋白处理的培养皿中,以免疫细胞化学鉴定贴壁细胞的内皮标志Flk-1和vWF,并以流式细胞仪分析其干细胞标志AC133。结果：贴壁细胞的内皮标志Flk-1和vWF是逐步出现的,d3时有27.0%贴壁细胞表达Flk-1,vWF不表达,d7时已100%表达vWF和Flk-1,纤连蛋白促进贴壁细胞内皮标志Flk-1和vWF的表达,d3时的表达百分率分别为34.0%和47.0%,d7时Flk-1和vWF的表达均为100%,在培养过程中,AC133阳性细胞的比例迅速下降,但纤连蛋白对AC133的表达无显著影响。结论：在内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志迅速消失,向内皮细胞分化,内皮细胞的表型是逐步出现的,纤连蛋白促进内皮祖细胞的分化。     

脐血造血细胞扩增后细胞成分的变化

目的　探讨人脐血造血细胞体外扩增细胞数量和质量的变化及收获的最佳时机。方法　用重组人白细胞介素 - 3(rh IL- 3)、粒单集落刺激因子 (GM- CSF)和重组促红细胞生成素 (rh EPO)长期培养人脐血单个核细胞 ,动态观察其细胞构成和集落生成能力。结果　培养 1周后细胞总数逐渐增多 ,3周末细胞总数最多 ,扩增倍数为 (8± 4)倍 ,细胞构成则以髓系细胞为主 ;淋巴细胞 (CD3+ 、CD19+ )培养 1周明显下降 ,2周后低水平维持 ;培养 2周时 CD34+ 细胞百分比最高 ,为 (2 .4± 0 .7) % ,培养 3周时 CD34+ 细胞扩增倍数最大 ,为 (30± 7)倍 ,其中CD33+ CD34+ 细胞扩增倍数为 (4 5± 5 )倍。 CD71+ 细胞以培养 2周时最多 ,最高为 (5 1± 8) % ;CD42 a+ 细胞培养 3周时最高 ;单位数量细胞集落生成能力培养 ,1周时最大 ,但总的集落生成能力第 3周时最大。结论　含有上述生长因子的培养体系主要扩增脐血造血细胞的髓系细胞 ,次要扩增红系、巨核系细胞 ,最佳扩增时机为 3周。     

体外培养人脐带血间充质干细胞向胰岛细胞分化及对糖尿病治疗的实验研究

目的研究人脐带血间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。方法体外分离培养HUCB-MSCs,在胰岛细胞培养条件下经药物定向诱导其分化;免疫组化对诱导细胞进行胰岛β细胞标记鉴定;双硫腙染色鉴定锌离子表达及检测胰岛样细胞的移植效果。结果 HUCB-MSCs经诱导后,免疫细胞化学染色显示表达人胰岛素;双硫腙染色呈棕红色;移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低。结论 HUCB-MSCs在体外诱导培养条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这种细胞可能为Ⅰ型糖尿病提供一条新的治疗途径。     

葛根素对脐带间质干细胞增殖与成骨分化的作用

葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种异黄酮类化合物[1]。已广泛应用于临床,可治疗多种疾病,如冠心病、心绞痛、心肌梗死等[2?4]。文献报道葛根素能够促进大鼠成骨细胞增殖,抑制破骨细胞的骨吸收活性,且能够促进大鼠骨髓间质干细胞