猪胰岛细胞分离纯化研究进展

目的综述猪胰岛细胞分离纯化的常用方法及最新研究进展。方法查阅近年来国内外关于猪胰岛细胞分离纯化的相关文献,进行总结分析。结果分离纯化的效果主要取决于供体的前期筛选、高质量胰腺的获取与有效保存,以及分离纯化方法的选择与改进。结论猪胰岛分离纯化操作的优化与标准化的建立,极大促进了异种胰岛移植研究的发展,有望解决目前移植供体短缺的问题。     

成人胰岛细胞的分离

目的　探讨成人胰岛细胞的分离及胰腺冷缺血时间与胰岛细胞活率的关系。方法　采取胰、肾联合切取 ,经腹主动脉插管 ,用自制的灌注器以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液 (HC A液 ) 15 0 0～2 0 0 0ml进行原位灌洗。将肾与胰腺、十二肠、脾分离 ,采用胶原酶P消化胰腺 ,分离并纯化胰岛细胞 ,以双硫腙及丫腚橙染色 ,测定所得到的胰岛细胞的纯度及活率。结果　胰腺的冷缺血时间为 2 .5～ 8h ,温缺血时间为 0～ 3min。胰岛收获量为 (2 .38± 0 .6 7)× 10 3 IEQ/g ,纯化后胰岛细胞的活率为 19%～ 83% ,冷保存指数 (或输注指数 )为 9.8～ 6 6 .4。胰岛细胞的活率与胰腺的冷缺血时间呈负相关 ,冷保存指数和胰岛细胞活率呈负相关。结论　以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌洗、胶原酶P消化胰腺所得到的胰岛细胞活率高 ,但胰腺的冷缺血时间不宜超过 5h。     

成人胰岛细胞的分离纯化及初步的临床应用

目的分离及纯化成人胰岛,以用于同种胰岛细胞移植。方法利用胶原酶灌注消化以及Ficoll分离液分层纯化的方法获得成人胰岛细胞,并应用于2例临床糖尿病患者。结果经双硫腙染色鉴定,分离纯化后的胰岛细胞活性达到80%~90%;且经胰岛素释放试验表明,实验中收获的胰岛具有良好的胰岛素分泌功能。经临床试验,1例糖尿病患者在输入此胰岛后,已脱离胰岛素治疗;另1例患者已停止服用降糖药。结论用胶原酶灌注消化及Ficoll分离液分层纯化的方法获得成人胰岛细胞是可行的。     

小鼠胰岛的分离及胰岛移植

目的研究小鼠胰岛分离和移植的方法。方法在Gotoh等所介绍的小鼠胰岛分离方法的基础上作了一些改进,由原来经胆总管注入胶原酶消化液改为由胆囊注入,并在消化液和Ficoll分离液中加入了胰酶抑制剂和BSA。结果使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的41.7±13.2个提高到了266.5±32.1个(P<0.01),活性在95%以上,除了少量导管外几乎不含腺泡组织。结论改进后的方法可以在肉眼条件下注入消化液,而不需要解剖显微镜,既方便了操作又提高了成功率;避免了整个消化和分离过程中胰酶对胰岛的消化作用,提高了得率,且具有很好的重复性。     

中华鳖胰岛细胞分离及生物活性检测

目的 探讨中华鳖胰岛细胞分离、提取方法及对其功能评价,为临床胰岛移植探索一种新的供体来源.方法 采用胶原酶消化分离中华鳖胰岛细胞,在体外用不同浓度的葡萄糖刺激胰岛细胞,测定其生物学活性.结果中华鳖胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激具有明确的生物学反应,并随着葡萄糖浓度的增加胰岛素的产生也相应增加.结论 采用胶原酶消化分离中华鳖胰岛细胞的方法可行,胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激产生胰岛素并具有正相关,其为爬行纲与哺乳纲动物之间的胰岛细胞移植提供实验基础.     

三种消化酶在大鼠胰岛分离纯化中的效果比较

目的　分别用 3种酶消化大鼠胰腺 ,比较分离纯化后胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能。方法　将 2 1只SD大鼠按应用释放酶、胶原酶P、胶原酶V消化胰腺随机均分为A、B、C组。结果　A组的胰岛细胞收获量比B组或C组多 ( 93 0± 78比 692± 68或 70 6± 70 ,P <0 .0 5 ) ;纯度比B组或C组高 ( 93 .8± 2 .3比 88.4± 2 .0或 89.2± 2 .1,P <0 .0 5 ) ;成活率比B组或C组高( 97.2± 1.4比 92 .2± 1.9或 92 .9± 2 .1,P <0 .0 5 ) ;A组培养后胰岛素分泌量和葡萄糖刺激时胰岛素分泌量比B组或C组多 (P <0 .0 5 ) ;A组逆转糖尿病大鼠的高血糖状态时间比B组或C组长( 7.5± 1.3比 5 .8± 1.6或 6.3± 1.2 ,P <0 .0 5 )。结论　与胶原酶P和胶原酶V比较 ,释放酶消化大鼠胰腺可提高胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能。     

胰岛分离、纯化制备的改进

目的 探讨大型哺乳动物胰岛机械化大量分离、纯化的方法,为人类胰岛移植物的大量制备摸索创造条件.方法 应用改进的机械化胰岛分离、纯化系统,用HCA和UW液顺序原位灌洗犬胰腺,主副胰管插管,4℃胶原酶-V(1.5 g/L)+胰酶抑制剂pefabloc(0.4 mmol/L)灌注后,Ricordi-Chamber消化罐消化,4℃COBE2991连续密度梯度离心纯化,测定胰岛当量(IEQ)、胰岛纯度及存活率、胰岛素及C-肽的释放量、培养24 h后光镜及电镜观察.结果 胰腺消化时间为(25.0±6.0)min,胰岛外分泌腺包裹率为(9.4±2.4)%,消化后胰岛收获量为(17.2±3.6)×104IEQ/每个胰腺,纯化后胰岛收获量为(8.3±2.0)×104IEQ/每个胰腺,胰岛纯度为(89.7±3.5)%.纯化胰岛体外低糖与高糖刺激下胰岛索分泌量及C-肽的释放量良好,培养24 h后形态结构及功能正常.结论 本实验室改进的胰岛机械分离方法及各设备运行可靠,获得的胰岛形态功能良好,可望用于临床人类胰岛的大量制备.     

大鼠胰岛分离、纯化技术改良

目的:探讨SD大鼠胰岛分离、纯化的较优方案,并评价依该法分离所得胰岛的生物学特性。方法:以浓度为0.75mg/ml的Ⅺ型胶原酶经胆管充分灌注大鼠胰腺;完整分离后以37℃水浴振荡消化17min,Dextron70不连续密度梯度(1.091、1.081及1.037)离心法分离、纯化胰岛;以DTZ染色鉴定胰岛并计算得率,AO-PI染色检测胰岛活性,糖刺激试验判定胰岛功能,胰岛"细胞免疫细胞化学鉴定"细胞,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果:纯化后,每只大鼠胰岛收获量为(743.60±43.07)个,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%。在45min内每10个胰岛细胞在低糖和高糖刺激下分泌的胰岛素浓度分别为(25.35±7.00)μIU/ml和(86.48±12.75)μIU/ml。结论:依改良后的分离纯化方案分离大鼠胰岛可获得高纯度高活率的胰岛细胞,且细胞形态正常、功能良好。     

细胞凋亡与脊髓损伤

细胞凋亡是有别于细胞坏死的一种细胞程序性死亡,在脊髓损伤特别是继发性损伤中起着重要的作用。细胞凋亡过程是一个非常复杂的病理过程,有许多因素诱导或参与了细胞凋亡,通过对这些因素的了解,外界可以对这一过程进行阻断,使脊髓原发损伤中幸存的细胞继续存活,从而保留更多的神经功能。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对大鼠胰岛分离纯化的影响

目的探讨大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）在大鼠胰岛分离纯化中对胰岛产量及功能的影响。方法按胶原酶中是否加入STI将大鼠分为实验组和对照组，实验组在胶原酶消化液中按2．0mg／ml加入STI，对照组不添加STI。2组均运用胶原酶原位灌注大鼠胰腺的方法来分离胰岛，使用Ficoll-400用非连续梯度离心法纯化胰岛，将纯化前、后获得的胰岛进行计数，并对纯化后的胰岛进行形态、功能检查。同时进行大鼠同种异体胰岛移植观察其体内功能。结果实验组和对照组在消化后纯化前所得胰岛数量无明显差别[（624&#177;38．2）IEQVS（586&#177;37．7）IEQ，P〉0．053；在纯化后实验组与对照组所得胰岛数量[（408&#177;28．3）IEQVS（189&#177;27．1）IEQ，P〈0．05]和纯度[（93&#177;2．4）％VS（75&#177;2．1）％，P〈0．05；差异有统计学意义。实验组与对照组最终所得胰岛的体外功能差异无统计学意义（P〉0．05），体内功能实验结果差异亦无统计学意义（P〉0．05）。结论使用在胶原酶中加入STI的消化液原位灌注大鼠胰腺，可以明显提高大鼠胰岛的最终产量和纯度，但对胰岛的功能无明显影响。     

带血管蒂复合组织移植缺血再灌注损伤时的细胞凋亡

目的 探讨带血管蒂同种异体复合组织移植缺血再灌注损伤(IR injury)时的细胞凋亡现象及细胞凋亡在此过程中的生物学效应。方法 通过流式细胞仪、生物电镜、脱氧核糖核酸转移酶介导原位缺口末端标记(TUNEL)技术及DNA电泳等方法,探讨了兔复合组织移植IR损伤时的细胞凋亡现象及其发生的规律。结果 在缺血再灌注后6h,生物电镜即可观察到典型的凋亡细胞;再灌注后6、12h,IR组中TUNEL法可检测到阳性细胞;DNA电泳可观察到典型的梯带;流式细胞仪检测发现,缺血再灌注后12h,IR组细胞凋亡率可达20％。结论 带血管蒂同种异体复合组织移植IR损伤时存在着细胞凋亡,而且,细胞凋亡可能是造成IR损伤的机制之一。     

提高冻存胚胎胰岛移植效果的实验研究

目的探讨三维组织细胞旋转培养系统(RCCS)对胚胎胰岛冻存复苏后质量的影响。方法将胚胎胰岛平均分为3组,实验组1、2为胚胎胰岛冻存前后分别用RCCS培养和普通培养,对照组新鲜胰岛经RCCS培养。切取胚胎胰腺,胶原酶V消化,纯化。然后进行标准冻存步骤,复苏后继续培养。并检测各组胰岛数量、活性、胰岛素刺激实验结果。结果纯化后收获胰岛最多每个胚胎5012.73IEQ,最少2432.68IEQ,平均(3548.07±273.46)IEQ。微重力培养组胰岛细胞存活率、胰岛素释放量、胰岛素刺激指数等均高于普通培养组。移植经过微重力培养的(2000±1)%IEQ新鲜胚胎胰岛或冻存胚胎胰岛在移植后1周内可达100%纠正糖尿病。结论微重力旋转培养有利于胰岛细胞的生长繁殖,使胰岛具有更好的胰岛素分泌能力,该方法同胰岛冻存相结合,可以进一步提高胰岛的冻存效果,为胰岛库的成功建立探索出一条新的途径。     

Pretreatment with bilirubin protects islet against oxidative injury during isolation and purification

Background

A high yield of pure, viable islets is one of the most important prerequisites for successful islet transplantation. However, during isolation and purification, many factors may cause oxidative stress, impacting islet viability. Accumulating evidence indicates that bilirubin (BR) not only has antioxidative but also has cytoprotective activities. In this study, we investigated whether pretreatment with bilirubin would protect islets against oxidative damage during isolation and purification.

Methods

Wistar rats were randomly divided into control and BR groups. The latter rats received an injection of BR 2 hours before islet isolation, whereas the controls received vehicle. Islet purity was determined using a dithizone stain. Survival rate and viability were determined using acridine orange and propidium iodide staining and the Cell Counting Kit-8 Kit. Islet function was quantified by testing glucose-stimulated insulin secretion. Islet damage caused by oxidative stress was quantified by measuring the malondialdehyde (MDA) in freshly isolated islets.

Results

Pretreatment with bilirubin did not enhance the purity, but significantly enhanced the survival rate and viability of the islets. Islet function in the BR group was significantly better than that in the control cohort. The MDA level was 0.62 ± 0.23 nmol/L/μg protein in the BR group, which was significantly lower (P < .05) than that in controls (1.31 ± 0.34 nmol/L/μg protein).

Conclusions

We concluded that oxidative stress during islet isolation and purification can be mitigated by BR pretreatment. BR exerts antioxidant and cytoprotective properties by reducing lipid peroxidation (MDA) and enhancing islet viability and function. Pretreatment with BR may become a simple, clinical applicable means to improve human islet isolation and transplantation outcomes.     

小鼠胰岛的分离与纯化

目的 探讨稳定、高效的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法.方法 采用胆总管内灌注不同浓度胶原酶(分别为0.5、1.0、1.5 g/L)消化胰腺的方法分离BALB/C小鼠胰岛,Ficoll-400不连续密度梯度离心法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,葡萄糖刺激释放试验体外测胰岛功能.结果 不同浓度的胶原酶在不同时间内消化胰腺后收获的胰岛数量有较大的差异,其中采用0.5 g/L胶原酶V、38 ℃水浴消化20 min组收获量最大为(230±20)个胰岛细胞团,纯度约为90%.DTZ染色后胰岛呈腥红色,形态完整.葡萄糖刺激释放实验示高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激后的2.3倍.结论 胶原酶浓度、消化时间和温度是影响小鼠胰岛分离结果的重要因素,当胶原酶浓度为0.5 g/L,消化时间20 min时可获得数量较多,纯度较好的胰岛细胞.

Abstract：

Objective To investigate the stable and efficient method of isolation and purification from mice pancreas. Methods BALB/C mouse islets were isolated by different concentrations of collagenase digestion (0. 5, 1. 0, 1. 5 g/L respectively) and purificated by Ficoll density gradient centrifugation.The number, purity and vitality of the islets were analyzed. The production and purity of the islets were checked by Dithizone immunofluorescence staining. The glucose-induced insulin secretion was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for islet function in vitro. Results Different number of islets was obtained by mice pancreas digestion with different concentrations of collagenase and for different digestion durations.After the mouse pancreata were digested in 38 C and with 0. 5 g/L collagenase V for 20rmin, maximum number of islets was obtained, and the purity of the final preparation was ＞ 95%. After culture in vitro, insulin release of islets under high glucose stimulation was 2. 3 times of that under low glucose stimulation. Conclusion Concentration of collagenase, temperature, and digestion duration were important factors of islet isolation and purification from mice pancreas. More production and higher purity of islets were obtained under the concentration of 0. 5 g/L collagenase Ⅴ for 20 min.     

成年猪胰岛的分离与纯化

目的　研究成年猪胰岛的分离与纯化方法。方法　胰岛的分离采用导管内连续灌注胶原酶消化法 ,纯化采用Nycodenz连续密度梯度离心。 结果　消化后每个胰腺平均可获得 (3970 0 0±185 96 3)个胰岛或 (986 0± 3 0 43)个胰岛 /克胰腺组织 ,纯化后为 (1480 0 0± 890 0 0 )个胰岛 /胰腺或(3 75 0± 493)个胰岛 /克胰腺组织 ,纯度 >95 %。体外培养示胰岛对糖刺激反应良好 ;免疫组织化学检查证实胰岛细胞存活。结论　经本法获得的胰岛具有较高的纯度及良好的功能 ,可为临床提供可靠的移植物来源。     

新型胰岛分离液对小鼠胰岛分离效果的研究

目的  探讨新型胰岛分离液（IPS液）在小鼠胰岛分离中的分离效率及胰岛保护作用。方法  将消化后的小鼠胰腺按体积平均分为两组（IPS组和UW组）,分别应用IPS-Optiprep液及UW-Optiprep液进行连续梯度密度离心分离胰岛,比较两组分离液的分离纯化效率和分离后的胰岛活性。将诱导成功的糖尿病小鼠随机分为3组：实验组（n=10）,接受采用IPS-Optiprep液分离纯化的胰岛移植;对照组（n=10）,接受采用UW-Optiprep液分离纯化的胰岛移植;假性移植组（n=5）,仅给予手术但并不进行胰岛移植。分析3组小鼠术后血糖水平以及测实验组和对照组小鼠术后21 d的腹腔葡萄糖耐量试验的血糖水平。比较两种分离液的配制成本。结果  与UW组相比,IPS组的IPS-Optiprep液可提供更高的胰岛当量（IEQ）、胰岛纯度、回收率及胰岛完整度。胰岛形态观察可见,IPS组胰岛被膜完整,直径明显大于UW组。UW组纯化后的胰岛活性率高于IPS组[（88±5）%比（84±3）%,P < 0.01]。与UW-Optiprep液相比,IPS-Optiprep液可获得相当的在体胰岛功能。IPS-Optiprep液可显著降低胰岛分离纯化成本。结论  新型胰岛分离液IPS-Optiprep液在胰岛分离提纯中显示出较好的分离效率,增加了胰岛的纯度、完整度与回收率,并显著降低了纯化成本,但对胰岛细胞活性的保护作用稍逊,可能与胰岛的高完整度及IPS-Optiprep液中的内毒素有关。     

共微囊化异种肝细胞胰岛联合移植治疗急性肝衰

目的　探讨共微囊化异种肝细胞胰岛联合移植对急性肝衰的治疗作用。方法　D 氨基半乳糖诱导小鼠急性肝衰 ;Seglen法分离大鼠肝细胞 ;Sutton法分离胰岛 ;自制双喷头成囊器制备微囊。比较生理盐水、自由肝细胞移植、微囊化肝细胞移植、共微囊化肝细胞胰岛联合移植 4组间存活率、体重、谷丙转氨酶、血清白蛋白、总胆红素、血糖等指标的变化情况。结果　共微囊化肝细胞胰岛联合移植组存活率达 10 0 % ,组间差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,各项生化指标也明显占优。肝细胞与胰岛 β细胞可在微囊内融合。 结论　共微囊化肝细胞胰岛联合移植对氨基半乳糖诱导的急性肝衰有最佳的治疗作用     

影响成人高质量胰岛分离的关键因素分析

目的探讨在胰岛分离过程中影响胰岛分离数量和活性的关键因素,以期进一步提高胰岛移植效果。方法通过分组观察以下因素对胰岛分离效果的影响:(1)胰腺重量和所用酶的量的比例;(2)胰腺消化过程中的震荡频率和幅度;(3)DNaseI 对胰岛分离的影响;(4)胰腺消化后的残余组织量与进行纯化的次数的关系;(5)消化下来的组织在 UW 液中放置的时间.结果当胰腺重量<70g,给予分散酶0.25g;胰腺重量70～120g,给予分散酶0.5g;胰腺重量>120 g,给予分散酶0.75g;消化10min 后震荡频率为100次/min,垂直幅度2～3 cm;向稀释液中加入 DNaseI;一次纯化过程加入消化胰腺组织最大量不超过20g;将纯化前的胰岛在 UW 液中放置30 min,获得纯化后胰岛数在(4459.28±704.51)～(5018.46±952.36)IEQ/g 胰腺组织,胰岛收获率在(79.06±12.53)%～(86.03±16.12)%,胰岛素刺激指数在(5.21±1.55)～(6.91±2.03),均高于对照组。结论消除上述关键影响因素的负面影响,可以明显提高胰岛分离数量和活性。