2008年广东省肠道病毒71型分离株全基因组核苷酸序列分析

目的 了解2008年广东省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法 选择2008年广东省分离的1株EV71毒株(GDFS-3),进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析.结果 GDFS-3株与其他EV71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5'UTR和3'UTR的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与中国台湾流行株(TW984)的同源性最高(为96.0%),与新加坡流行株SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81.0%左右.氨基酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与TW984同源件最高(99.0%).根据VP1基因序列构建亲缘性关系树,GDFS-3株与C4亚型(subgenogroup)聚为一簇,与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性为91.0%～95.0%.结论 遗传进化分析表明,GDFS-3株和中国台湾2004年流行的EV71毒株的亲缘关系最为密切,属于C4亚型,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.5'UTR的突变对于EV71毒力增强可能有重要作用.上述结果 有助于EV71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.     

2008至2009年北京地区分离的肠道病毒71型全基因组序列分析

目的了解2008至2009年从北京地区手足口病（HFMD）患儿分离到的肠道病毒71型（EV71）全基因组序列特点（未包括多聚腺苷尾）,以探讨基因序列的改变是否与病毒的致病性有关。方法选取首都儿科研究所病毒研究室2008年分离到的5株EV71毒株和2009年分离到的4株EV71毒株,其中4株来源于重症HFMD患儿（伴高热、持续抽搐及意识丧失等中枢神经系统症状）,5株来源于轻症HFMD患儿。设计覆盖病毒全基因组的10对特异性引物,对9株EV71毒株进行RT-PCR扩增、全基因组序列测定和分析。结果 9株EV71毒株的全基因组长度为7406bp或7405bp,部分毒株在5′UTR存在1处1个碱基的缺失。9株EV71毒株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为96.3%～99.4%和98.2%～99.6%,在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为96.9%～99.9%和98.3%～100.0%。重症HFMD来源的4株毒株中有3株在VP2蛋白第144位及3D聚合酶（3Dpol）第140和263位同时出现相同的氨基酸变异（T144S、R140K和I263V）,并且在5′UTR区第208和254位同时出现相同的碱基变异（G208A和A254G）。9株EV71毒株的全基因组与C4亚型毒株具有最高的核苷酸同源性,在VP1区为94.3%～95.5%;在3D及3′UTR区与CV-A16/G10的同源性（84.3%～85.0%和89.0%～91.5%）高于与EV71-B型、A型及C型（C1～3、C5）的同源性。VP1和3D基因的遗传进化分析显示,9株EV71毒株与C4亚型毒株属同一分支。结论 VP2蛋白第144位氨基酸突变（T→S）、3Dpol第140和263位氨基酸突变（R→K和I→V）及5′UTR区第254位碱基突变（A→G）可能与EV71感染后引起的不同临床症状有关。根据VP1核苷酸序列,2008至2009年北京地区流行的EV71属于C4亚型;非结构蛋白基因在EV71进化中可能有一定的作用。     

2009年肠道病毒71型广州分离株的全基因组序列分析

目的分析2009年肠道病毒71型广州分离株GZHY09的全基因组序列,并与GenBank中的序列进行分析比对。结论从GenBank上选不同地区的EV71全基因组序列,设计相互重叠的覆盖病毒整个基因组序列的12对引物,采用RT-PCR扩增出12个基因片段,通过测序获得全基因组序列,并参考国内外各EV71基因型的分离毒株,用MEGA4软件进行进化树分析,用DNAStar软件中的MegAlign进行同源性分析。结果 12个重叠基因片段序列拼接获得EV71全基因组序列,共7404个核苷酸,同源性分析结果表明在VP1区,GZHY09株与中国大陆的Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08的核苷酸序列同源性比较高,其中以Anhui08最高（97.7%）。结论 GZHY09属EV71病毒的C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上属于同一基因型,与Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08具有高度的同源性。     

2008-2009年北京分离的肠道病毒71型基因组3'末端序列分析

目的 了解2008-2009年北京分离的肠道病毒71型(EV71)基因组3'末端的基因特征(未包括多聚腺苷尾),探讨是否与病毒的致病性有关.方法 于2008-2009年手足口病流行期间采集来首都儿科研究所附属儿童医院就诊的普通手足口病患儿和合并重症神经系统并发症患儿的咽/鼻拭子或疱疹液标本.将标本接种Vero细胞进行肠道病毒分离,同时设计肠道病毒通用引物、EV71和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异性引物通过巢式RT-PCR对分离到的肠道病毒进行型别鉴定.对引起不同临床类型感染的10株EV71分离株的基因组3'末端进行序列测定和分析.结果 10株EV71的3'末端均包含1386 nt的3D、终止密码子TGA和81 nt的3'UTR,由3D核苷酸序列所推导的3D蛋白含462个氨基酸.10株EV71的3D和3'UTR核苷酸同源性分别为95.8%～99.6%和96.3%～100%,重症来源的4株毒株中有3株在3Dpol第140位和第263位同时出现了相同的氨基酸变异(R140K和I263V).10株EV71的3D与C4亚型代表株具有最高的核苷酸和氨基酸同源性,分别为92.7%～94.2%和96.8%～97.6%;在3'UTR与CA16/G10具有最高的核苷酸同源性(88.9%～91.4%).3D区的遗传进化分析表明10株EV71在亲缘关系上与C4亚型最密切,与CA16/G10较密切,而与EV71其他基因型和亚型较疏远.结论 基因组3'末端在EV71进化中可能有一定的作用.     

肠道病毒71型中国分离株基因组3区的分析

目的 测定我国分离的肠道病毒71型(EV71)SHZH98株3C基因的核苷酸序列，进行遗传进化途径的分析。方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增我国分离的EV71-SHZH98株3C基因cDNA，测定PCR产物的核苷酸序列。结果 SHZH98株3C基因为549bp，和已发表的肠道病毒71型3C基因序列比较，SHZH98株与MS株同源性为78．7％，与BrCr株的同源性为76．7％，与台湾分离株POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为74．0％、73．8％、71．9％、69．8％。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列同源性比较显示与MS的同源性为93．45％，与BrCr、POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为89．1％、90．7％、90．2％、84．2％、82．5％。遗传进化分析显示SHZH98株3C片段在亲缘关系上与Coxsackievirus A16 G-10株及欧美分离株MS、BrCr株较密切，而与台湾分离株相差较远。结论 推测EV71病毒中国分离株非结构蛋白的进化途径可能与台湾流行株不同。     

肠道病毒71型实验室诊断研究进展

人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,最早是于1969 -1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到[1],之后世界上许多国家相继报道了EV71感染的流行,HFMD与EV71感染的关系也受到了广泛的重视.EV71与柯萨奇病毒(coxsackievirus)引起的手足口病不同,其感染性强、致病率高,是目前除脊髓灰质炎病毒以外导致婴幼儿神经系统疾病感染最重要的病原体,感染后可导致手足口病、无菌性脑膜炎、肺炎、疱疹性咽峡炎等,以上症状在患者中所占的比例分别为83％、11.1％、0.6％和1.2％[2].     

肠道病毒71型的分子病毒学研究进展

肠道病毒71(Enterovirus71,EV71)是导致婴幼儿感染的重要病原之一,自1974年首次报道以来,在世界范围内引起多次暴发与流行并且在我国地区的流行也呈上升趋势,该病毒感染具有较广的疾病谱,除引起大规模的手足口病暴发,也可引起严重的中枢神经系统感染,并可导致死亡,近年来受到人们的广泛关注.本文对EV71病毒生物学特征、分子流行病学、致病毒力及预防控制等方面的研究进展作一概述.     

我国广东、福建地区2000～2001年手足口病肠道病毒71型分离株的种系进化分析

目的 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测我国广东、福建地区2000-2001年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71)，进而通过扩增VP1节段的核苷酸序列，进行毒株的种系进化分析。方法以肠道病毒特异引物对EV-1、EV-2进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本，进一步用EV71特异引物对159S、162A进行RT-PCR，扩增的VP1节段经纯化后与测序载体pGEM-T连接，转化大肠埃希菌DH5a，筛选后测序。所得序列与我国深圳、上海、武汉地区的EV71流行株，中国台湾1998年4例HFMD暴发分离的EV71毒株，及来自美国、日本、匈牙利等国家地区的EV71毒株的核苷酸序列，用ClustalX1．8和PHYuP3．5进行比对分析，构建种系进化树。结果 25份标本检测EV71的阳性率为20％，所得序列经种系进化分析，与肠道病毒71型的其他毒株同源，与深圳1998年HFMD散发分离的EV71毒株同源性为94％，与上海2000年HFMD暴发分离株同源性为94％～96％，与武汉1987年HFMD病例中分离的毒株同源性为91％，而与国外EV71毒株同源性仅为82％～84％。结论 EV71是我国南方地区HFMD的主要病原之一；我国大陆地区的EV71毒株在种系进化上有较高的同源性；与我国台湾地区大部分分离株亦有90％～91％的核苷酸同源性，但大陆EV71引起的HFMD发病症状较轻，有别于1998年台湾地区EV71的大暴发。     

抗肠道病毒71型感染药物的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)的主要病原体,临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症[1].5岁以下的儿童感染后易发生严重的并发症,如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等,这些并发症可导致死亡或永久性麻痹[2].至今,在全球许多国家发生了EV71感染的暴发,造成病例大量死亡[3-4].目前对于EV71感染既无有效的疫苗,也无明确有效的抗病毒药物[5-6].该病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放,这些过程都可能成为抗病毒药物设计的靶点,按照作用的靶点不同将目前研究的抗EV71药物分为以下几个方面进行综述.     

深圳5例肠道病毒71型手足口病病毒株遗传衍化分析

目的调查来源于2008年深圳5例EV71（Enterovirus71,EV71）型手足口病患者的5株肠道病毒71型的分子流行病学特点及其分子进化关系。方法通过病毒分离培养得到5株肠道病毒71型分离株,并对其进行全基因组核苷酸序：列测定,通过生物信息学软件分析,与既往其他国家地区分离株进行全基因序列分析比较,以及进化树分析。结果通过对VP1和VP4基因序列分析,5株病毒株均属于C4基因亚型。5株EV71分离株在全长核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,其核苷酸和氨基酸同源性分别高于93．0％和98．0％,进化树分析提示2008深圳分离株与2004深圳株同源性最为接近,与2008安徽阜阳流行株和1998深圳株亦相距很近,死亡病例株与2008安徽阜阳株距离同源性最近（同源性为99．1％和96％）。结论推测这起疫情是由同一个病毒传播链引起的,本次流行株可能系1998深圳株演变而来。     

北京市2008年肠道病毒71型的RT-PCR鉴定及VP1区基因特征分析

目的 研究2008年北京市手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Human enterovirus 71,HEV71）的VP1编码区基因特征.方法 采集北京市朝阳区医院和幼儿园的HFMD患者标本共285份,进行HEV71特异性RT-PCR鉴定和病毒分离,随机选取10株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析.结果 129份标本RT-PCR鉴定结果 为阳性,阳性率为45.26%.10株HEV71在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上的差异分别在94.6%～99.6%和95.9%～100%之间.北京朝阳HEV71分离株属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 RT-PCR法可以快速、准确地鉴定HEV71.引起本次HFMD流行的HEV71为C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,提示自1998年起,C4亚型的HEV71在中国大陆有较广泛的传播.加强对HEV71的分子流行病学监测,了解HEV71的基因特征,对预防和控制HEV71在中国的暴发具有重要意义.     

肠道病毒71型手足口病的疫苗筛选和观察

目的 筛选安全有效新型EV71候选疫苗,为将来EV71疫苗开发应用奠定基础.方法 以重组蛋白VP1为疫苗设计靶点,不同候选疫苗包括灭活疫苗、DNA疫苗、VP1蛋白疫苗在0、2周、4周分别按照不同剂量和肌内注射途径免疫BALB/c雌性小鼠,在0、2周、4周、6周、8周、10周、16周分别采集小鼠尾静脉血,16周处死小鼠,收集小鼠脾脏细胞,检测小鼠体液免疫和细胞免疫功能,筛选评价候选疫苗的疗效和安全性.结果 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗免疫小鼠2周后IgG抗体滴度即开始升高,4周后明显升高,8周后达高峰,至少维持16周以上;IgG亚类以IgG2a和IgG1为主.三种疫苗能诱导以γ-IFN和IL-4为主的细胞免疫反应.灭活疫苗疗效优于其他候选疫苗,未发现疫苗相关不良反应.结论 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗均能诱导持久的特异性细胞免疫和中和抗体反应,以灭活病毒疫苗疗效较好,需要将来攻毒实验可进一步验证其免疫力.     

Sequence analysis of the first C2 subgenogroup strain of enterovirus 71 isolated in Korea

BackgroundEnterovirus 71 (EV71) is an important causative agent of hand-foot-and-mouth disease with severe neurological complications, which may lead to death in children. Large outbreaks caused by EV71 have frequently occurred in Asia-Pacific region.ObjectivesIn Korea, the outbreaks have been caused by EV71 subgenogroups C3, and C4. Only genogroup C, especially subgenogroup C1, C3, C4, and C5, has been detected by the national enterovirus surveillance system in Korea. This study reports the first isolation of EV71 A1451 strain, which belongs to subgenogroup C2.Study designEV71 was isolated from a Korean patient with meningoencephalitis. Complete genome analysis and phylogenetic analysis was performed to identify the characteristics of the strain.ResultsComparative genome analysis of the A1451 strain indicated that this novel C2 strain is associated with the Taiwan strains, which are recombinant virus combined with subgenogroup C2 and B3.ConclusionsBecause the subgenogroup B3 was not previously detected in Korea, the A1451 strain is regarded as an imported recombinant virus. Periodic surveillance of EV71 is required to control the spread of this disease and its introduction from overseas.     

Molecular epidemiology analysis of enterovirus 71 strains isolated in Dak Lak,Vietnam, 2011-2016

Human enterovirus 71 (EV71) is the major etiologic agent of hand, foot, and mouth disease (HFMD). EV71 outbreaks have been reported in Dak Lak in recent years, however, the genotypes/subgenotypes information and phylogeny of circulating EV71 strains are limited. The objectives of this study were to determine the genotypes/subgenotypes and investigate the phylogeny of EV71 isolates in Dak Lak over a 6-year period. Viruses were isolated from clinical samples from patients with HFMD. In total, 43 EV71 isolates circulated in Dak Lak during 2011-2016 were used for the phylogenetic analysis using complete VP1 gene. The phylogenetic analysis of the VP1 gene revealed that two major genotypes, B and C, were found. Among the 43 EV71 strains, 29 belonged to subgenotype C4, 2 belonged to subgenotype C5, and 12 belonged to subgenotype B5. Of these, the subgenotype C4 was predominant in 2011-2013 and this was later replaced by the subgenotype B5 in 2014. The subgenotype B5 was dominant between 2014 and 2015, and then C4 recirculated in 2016. Our study also indicated that the subgenotypes C4 and B5 emerged into Dak Lak were closely related to variants causing epidemics of HFMD in the southern and central region of Vietnam and Thailand. Sequence analysis showed that nine amino acid mutations were detected in the VP1 region. Our results identified two significant amino acid substitutions (D31N and E145G/Q) associated with enhancing EV71 virulence.     

广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体水平调查

目的调查广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体IgG（EV71-IgG）的水平,分析与EV71所致手足口病（HFMD）发病的关系。方法以来源于广州市妇女儿童医疗中心（我院）中心实验室分离到的EV71 C4亚型标本,制备EV71诊断抗原,建立EV71-IgG抗体诊断试剂盒方法,并进行实验室评价。收集2010年1~3月在我院儿保科抽血进行常规保健检测的标本,筛选出无发热、无HFMD症状的健康儿童血清标本,检测EV71-IgG抗体。选取我院2010年全年门诊及住院HFMD患儿的咽拭子标本进行EV71特异性核酸检测。结果①本研究建立的试剂盒EV71-IgG抗体检测临界值为0.148;与细胞中和实验方法阳性符合率为100%,阴性符合率为92%,与柯萨奇A16病毒抗体无交叉反应。②819名健康儿童血清标本中,男481名,女338名。〈1岁组（60%,60/100名）和~2岁组（39.3%,72/183名）EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各年龄组[~3岁、~4岁、~5岁和~14岁组分别为12.9%（15/116名）、27.1%（38/140名）、14.2%（16/113名）和22.8%（38/167名）]。EV71-IgG抗体阳性率无显著性别差异。③4 780例EV71阳性HFMD患儿中,男3 070例,女1 718例。〈1岁310例（6.5%）,~2岁1 157例（24.2%）,~3岁1 337例（28.0%）,~4岁1 094例（22.9%）,~5岁450例（9.4%）,~14岁432例（9.0%）。④各年龄组EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比呈相反趋势,〈1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高,EV71阳性年龄构成比最低;~3岁组EV71-IgG抗体阳性率最低,EV71阳性年龄构成比最高。结论 〈1岁健康儿童EV71-IgG阳性率最高,EV71阳性年龄构成比与EV71-IgG阳性率呈相关现象。     

青海省分离到肠道病毒71型及其VP1区基因特征分析

目的 研究2008年青海省手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的致病病原体中肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,HEV71）的VP1区基因特征.方法 采集青海省HFMD患者的粪便、疱疹液和咽拭子标本共335份,并进行病毒分离,然后对阳性分离株病毒进行肠道病毒血清型别的分子定型.对分离到的HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增,核苷酸序列测定和同源进化分析.结果 在335份临床标本中,共分离到45株阳性病毒分离物,其中30株鉴定为HEV71（占66.7%）,是主要病原体.对30株HEV71进行VP1区核苷酸序列测定后,分析发现它们在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别在95.2%～100.0%和96.6%～100%之间.它们与1998年以来在我国分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高.与其他35株各基因型和基因亚型的HEV71代表株构建的亲缘进化树中显示,青海省HEY71分离株与C4亚型代表株聚为一簇,属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 青海省从HFMD病例中分离到HEV71,也确认了青海省HFMD的病原体HEV71流行株的基因型为C4基因型中的C4a进化分支,并且存在多个传播链.     

吉林省2009-2012年肠道病毒71型VP1编码区氨基酸位点的变异分析

目的分析2009--2012年引起吉林省手足口病（handfootandmouthdisease,HFMD）流行的肠道病毒71型（EV—A71）的VP1区氨基酸位点的特征性变异位点。方法对2009--2012年分离于吉林省HFMD病例的70株EV—A71分离株的VPl编码区进行逆转录．聚合酶链反应,然后对扩增产物进行核苷酸序列测定,使用Bioedit软件和MEGA4．0软件分析VPl区氨基酸位点的变异特征以及基因亲缘关系。结果2009--2012年在吉林省分离到的70株EV—A71均属于C4a基因亚型,其中69株与2008年安徽阜阳的分离株亲缘关系最近,并且这69株病毒在VPl编码区第22位氨基酸位点均由谷氨酰胺转变为组氨酸（Q—H）,与2008年安徽阜阳株一致。结论引起2009-2012年吉林省HFMD流行的EV-A71可能：来源于安徽阜阳流行株延续传播。