血友病A患者FVⅢ基因联合诊断及其DNA测序突变分析

目的 探讨血友病A(HA)患者及携带者的基因诊断方法及诊断率.方法 对20例HA患者及家系成员采用长距离PCR扩增(LD-PCR)技术、限制性内切酶酶切位点连锁分析(Bcl I PCR/RFLP)、可变串联重复序列多态性分析(St14 VNTR/PCR);并对FⅧ基因18号内含子的Bcl I区段、19号内含子的HindⅢ相应区段进行DNA测序.结果 检出22号内含子倒位携带者1例和倒位者6例;Bcl I PCR/RFLP酶切位点突变患者3例,携带者5例;St14 VNTR家系的连锁分析,发现携带者6例,患者5例;联合诊断家系总阳性率为90.0%;DNA测序两个区段突变位点分析,共发现5种突变.结论 采用联合基因诊断方法,对FVⅧ基因的3个位点进行联合基因诊断,可提高HA的诊断率及准确率;用PCR-DNA测序法可发现5种突变,并且这些突变位点在国内报道较少,22例患者突变检出率达50.0%.     

血友病A患者FⅧ基因联合诊断及其DNA测序突变分析

目的探讨血友病A(HA)患者及携带者的基因诊断方法及诊断率。方法对20例HA患者及家系成员采用长距离PCR扩增(LD-PCR)技术、限制性内切酶酶切位点连锁分析(BclⅠPCR/RFLP)、可变串联重复序列多态性分析(St14 VNTR/PCR);并对FⅧ基因18号内含子的BclⅠ区段、19号内含子的HindⅢ相应区段进行DNA测序。结果检出22号内含子倒位携带者1例和倒位者6例;BclⅠPCR/RFLP酶切位点突变患者3例,携带者5例;St14 VNTR家系的连锁分析,发现携带者6例,患者5例;联合诊断家系总阳性率为90.0%;DNA测序两个区段突变位点分析,共发现5种突变。结论采用联合基因诊断方法,对FⅧ基因的3个位点进行联合基因诊断,可提高HA的诊断率及准确率;用PCR-DNA测序法可发现5种突变,并且这些突变位点在国内报道较少,22例患者突变检出率达50.0%。     

非缺失型DMD/BMD家系中基因携带者的短串联重复序列多态性连锁分析

目的 准确检出非缺失型杜氏／贝氏进行性肌营养不良症（Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)家系中女性携带者，为产前基因诊断提供信息。方法 利用dystrophin基因中5个短串联重复序列多态位点（STR－44，STR－45，STR－49，STR－50和5'-DysⅡ）的特异寡核苷酸引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰烯酰胺凝胶电泳分离，DNA片段的多态性用连锁分析其家系中各成员的基因单体型。结果 连锁分析了8个家中26名女性亲属基因型，检出16名女性DMD／BMD携带者和10名非携带者。结论 5个短串联重复序列多态位点的联合连锁分析，可较准确而简便地检出DMD／BMD家系中的女性携带者。     

血友病甲基因分析技术的改进及其在产前诊断中的应用

目的对血友病甲基因分析技术进行改进并应用于携带者检查和产前诊断。方法长距离聚合酶链反应方法直接检测凝血因子Ⅷ第22内含子倒位,对非倒位家系用FⅧ基因内限制酶切位点XbaⅠ、HindⅢ、二核苷酸重复序列多态性位点STR13和STR22,以及基因外可变数目串联重复序列DXS52(St14)位点进行基因连锁分析。结果52个家系共检出71位携带者。21个家系为第22内含子倒位,28个家系经连锁分析得到明确诊断,3个家系无法诊断,可诊断家系占94.2%。为18个家系做胎儿产前诊断,其中10例诊断为血友病甲胎儿;诊断7例正常男胎和1例携带者女胎,随访1年发育正常。结论应用长距离聚合酶链反应和多位点基因连锁分析技术可以快速有效地进行血友病甲携带者检查和产前诊断。     

DXS52(St14)在血友病甲基因诊断中的方法改进及应用

目的 改进DXS52(St14)在血友病甲(hemophilia A,HA)基因连锁分析中的实验方法并应用于基因诊断,报道DXS52位点与FⅧ基因发生重组的2个家系.方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳对61个非倒位HA家系的DXS52位点进行基因检测,并用FⅧ基因内的Bcl Ⅰ、HindⅢ、Xba Ⅰ、STRl、STRl3、STR22和STR24这7个位点以及DXS52位点对这61个家系进行基因连锁分析.结果 DXS52位点在43个HA家系中可提供信息,可诊断率为70.5%(43/61).其中8个家系仅DXS52单个位点能提供信息,占13.1%;两个家系的DXS52与FⅧ基因发生基因重组.结论 采用新的实验条件可使DXS52位点基因检测得到准确清晰的实验结果.该位点可诊断率高,目前是HA连锁基因分析中不可缺少的诊断位点,但该位点位于FⅧ基因外,与FⅧ基因间存在重组可能,单独应用于诊断时应谨慎.

Abstract：

Objective To improve the experimental method of DXS52 (St14) and apply it to genetic testing for hemophilia A (HA). Methods PCR of DXS52 and agarose gel electrophoresis were performed for genetic testing in 61 non-inversion HA families. Linkage analysis of 7 loci within the FⅧ gene including Bcl Ⅰ , Hind Ⅲ, Xba Ⅰ , STR1, STR13, STR22 and STR24 were also carried out for the 61 families.Results DXS52 can provide information in 43 out of 61 families and the diagnostic rate was 70. 5%. Eight families can be diagnosed only by DXS52 locus, accounting for 13. 1%. Two families were found to have recombination between DXS52 and FⅧ. Conclusion The new experimental conditions can reach accurate and clear results in DXS52 genetic testing. This gene maker has high diagnostic rate, so it is an indispensable linkage analysis method in HA gene diagnosis. More caution should be paid when using the extragenic locus DXS52 to perform gene diagnosis because of its high recombinant rate with FⅧ.     

甲型血友病家系的直接和间接基因诊断

目的该研究针对温州地区甲型血友病(HA)家系,首先进行直接基因诊断,然后根据可变数目串联重复序列(VNTR)多态性、短串联重复序列(STR)多态性和限制性片段长度多态性(RFLP)进行间接基因诊断,为基于HA症状前、携带者基因诊断结果的遗传咨询和生育指导提供依据。方法针对HA先证者及其有关家系成员,首先采用倒位位移PCR(IS-PCR)进行凝血因子Ⅷ(FⅧ)inv22、del22、dup22、inv1的检测。然后进行单体型基因连锁分析。采用PCR检测FⅧ基因外的DXS52(St14)位点的VNTR多态性,检测FⅧ基因外的DXS15(CA)n、DXS9901(GT)n、DXS1073(GT)n位点和内含子1(GT)n、13(CA)n、22(GT)n(AG)n、24(GT)n位点的STR多态性并经毛细管电泳确证。另外采用PCR产物限制酶切检测FⅧ基因的内含子18、19、22位点的RFLP多态性。结果以2个HA家系为例报道研究结果。家系三的先证者为远端Inv22患者,先证者母亲为远端inv22携带者,先证者父亲为正常者。先证者、先证者母亲、先证者父亲均未发生del22或dup22,并且均未发生inv1。家系五先证者外婆肯定不是携带者,先证者的X染色体来自外公,但已知外公不是患者,那么按照最大风险估计,母亲的那条来自外公的X染色体在外公生殖细胞中FⅧ基因发生了突变,因此母亲是携带者。结论该研究的HA家系的直接和间接基因诊断,特别是对症状前男孩的诊断、对未曾有患病后代的女性携带者的检出,具有非常重要的实际意义,可以为遗传咨询和生育指导提供可靠依据。     

联合应用PCR-单链构象多态性和短串联重复序列连锁分析方法进行20例苯丙酮尿症产前基因诊断

目的 建立技术简便、准确性高的苯丙酮尿症产前基因诊断方法,探索遗传性疾病的产前基因诊断的临床应用价值.方法 应用聚合酶链反应.单链构象多态性和短串联重复序列连锁分析的方法,对20例经典型苯丙酮尿症再怀孕家系进行了产前基因诊断.结果 经过产后基因诊断和新生儿血苯丙氨酸浓度筛查的验证,取得令人满意的产前诊断结果.结论 联合应用聚合酶链反应.单链构象多态性和短串联重复序列方法是技术简便、准确性高的产前基因诊断方法,具有较高的临床应用价值.     

联合STR连锁分析和PCR-SSCP分析对新疆地区PKU基因诊断

联合采用PCR -STR和PCR -SSCP 2种基因诊断方法分析 5个PKU家系。除家系 4母亲为STR纯合型外 ,其余家系双亲皆为杂合子。对家系 1(维族 ) 1例风险胎儿 (妊娠 6周流产 )进行了产前基因诊断和 1例新生儿 (出生 1天 )进行了基因诊断 ,均为携带者 ,并经出生后证实。应用PCR -SSCP分析发现 ,家系 2 (回族 )患儿为Exon7突变纯合子 ,家系 4 (汉族 )患儿为Exon7和Exon11突变复合体 ,其Exon11突变位于第 399位点 (GTA→GTT) ,可能为一致病突变。实践证明上述 2种基因诊断方法联合使用可对 5个家系所有其他成员进行 10 0 %基因诊断和产前基因诊断 ,并可有效检出突变所在位置。     

三个先天性长QT综合征家系的基因分型

目的　对 3个先天性长 QT综合征 ( long QT syndrome,L QTS)家族成员进行基因诊断。方法　应用位于 H ERG和 SCN5 A基因内和邻近的短串联重复序列 ( shorttandem repeat,STR)位点确定染色体单体型 ,对 3个汉族 L QTS家系进行单体型连锁分析。结果　临床诊断患者 15例 (其中 3例死亡 ) ,疑似患者 11例。单体型连锁分析结果 :L QTS患者 14例 ,排除 2例假阳性患者和 7例疑似患者。家系 1的致病基因位于 SCN5 A,家系 2和家系 3的致病基因位于 H ERG。结论　单体型连锁分析能为 L QTS基因分型和症状前诊断提供有效手段。     

X染色体上五个多态位点筛选及其多态性分析

目的从X染色体上筛选多态性较强的多态位点,为X连锁遗传病的连锁分析和基因定位奠定基础。方法利用BCMSearchLauncher程序从相关基因组序列中筛选短串联重复序列。利用Primer3设计扩增短串联重复序列的引物,采用PCR扩增技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对所筛选出的短串联重复序列进行多态性分析。结果从X染色体相关区域中筛选出8个短串联重复序列,多态性分析表明,其中的5个短串联重复序列具有多态性,χ2检验表明,各位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),且具有较高的杂合度。结论从X染色体上筛选出5个多态位点,可用于X染色体基因的连锁分析和基因定位。     

马凡综合征微纤维蛋白1基因突变检测及单倍型连锁分析

目的：检测中国人马凡综合征（Marfan syndrome,MFS)患者微纤维蛋白1（fibillin-1,FBN1)基因的突变及对马凡综合征患者的家系成员进行症状前诊断。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性技术和测序方法，对汉族9个家系中共17个MFS患者进行基因突变检测；运用FBN1基因内4个内含子中的可变串联重复序列构建染色体单倍型，进行家系单倍型连锁分析和基因诊断。结果：发现MFS（A）家系Ⅱ1患者有单链构象改变，测序证实为位于FBN1基因第25号外显子3243－3256核苷酸之间有I个13bp的小片段缺失，为新位点基因移码突变，其序列为gcctctgcaccca;单倍型连锁分析发现MFS（B）家系Ⅲ1是1个无症状期患者。结论：中国人FBN1基因突变可以引起马凡综合征，应用突变检测与单倍型连锁分析方法能为马凡综合征基因诊断提供依据。     

用PCR-STR、ASPCR、PCR-SSCP技术对PKU患者进行产前基因诊断

为探讨苯丙酮尿症的产前诊断途径，应用３种基因诊断方法从不同角度对１６个苯丙酮尿症家系的苯丙氨酸羟化酶基因进行了分析。（１）聚合酶链反应－短串联重复序列连锁分析：通过扩增苯丙氨酸羟化酶基因内含子３中含短串联重复序列的ＤＮＡ区域，并进行扩增片段长度多态性分析，结果表明：能进行准确产前基因诊断者占６２．５％，能进行５０％排除诊断的家系占３７．５％，１例风险胎儿的产前基因诊断和另一家系生后１５天婴儿的症前诊断获得成功；（２）多重等位基因特异性聚合酶链反应，对苯丙氨酸羟化酶基因中两种最常见的突变点分析结果为：Ａｒｇ２４３Ｇｌｕ检出率为１９％，Ａｒｇ４１３Ｐｒｏ检出率为１２％；（３）应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析，不仅检出３例已知的基因突变，还发现２例可能为新的基因突变，诊断率达到４０％。为苯丙酮尿症的产前基因诊断提供了依据。     

应用连锁分析对ADPKD进行基因诊断及产前诊断

目的应用聚合酶链法对常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)家系进行症状前基因诊断和产前诊断。方法提取家系成员外周血或羊水DNA,PCR扩增与PKD1紧密连锁的SM6、AC2.5、CW 2 4个微卫星遗传标记,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,对4个ADPKD家系的36名成员(包括1名胎儿)进行基因连锁分析,分析各成员与疾病连锁的单体型。结果36例家系成员中检出了3例临床无症状,B超未提示多囊肾的PKD1基因携带者,产前诊断显示胎儿为未携带致病基因的正常个体。结论联合应用多个微卫星位点对ADPKD进行连锁分析能够对ADPKD家系成员进行基因诊断和产前诊断。     

用CPR—STR,ASPCR,PCR—SSCP技术对PKU患者进行产前基因诊断

为探讨苯丙酮尿症的产前诊断途径，应用３种基因诊断方法从不同角度对１６个苯丙酮尿症家系的苯丙氨酸羟化酶基因进行了分析。（１）聚合酶链反应－短串联重复序列连销分析；通过扩增苯丙氨酸羟化酶基因内含子３中停职短串联重复序列的ＤＮＡ区域，并进行扩增片段长度多态性分析，结果表明：能进行准确产前基因诊断者占６２．５％，能进行５０％，能进行５０％排除诊断的家系占３７．５％，１例风险胎儿的产前基因诊断和另一家系生后     

X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学检测

目的 采用多重置换扩增结合单体型分析及致病基因检测进行X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学检测。方法 利用位于CYBB基因两侧的16个短串联重复序列位点对一个X-连锁慢性肉芽肿病的家系构建单体型进行分析。活检的胚胎细胞通过多重置换扩增技术进行全基因组扩增，利用扩增产物检测具有多态性的STR位点与CYBB基因，同时采用位点Amel进行性别诊断。结果 对一个家系共进行了2个周期的PGT，家系分析结果显示7个STR位点具有多态性。共对16个胚胎进行了诊断，均获得诊断结果，诊断效率为100%，其中8个为正常胚胎，1个为携带者，7个为异常胚胎。全基因组扩增成功率100%，后续PCR成功率为99.3%(143/144),ADO率为14.0%(6/43)。先后进行了三次胚胎移植，末次移植后获得单胎妊娠，最终足月顺产一个不携带致病基因的健康男婴。结论 基于多重置换扩增产物对短串联重复序列进行连锁分析结合致病基因检测可对X连锁慢性肉芽肿病进行准确且有效的植入前遗传学检测。     

联合多个STR位点对血友病B家系进行携带者检出与产前基因诊断

目的通过血友病B家系遗传连锁分析，建立其产前诊断方法。方法应用PCR方法。检测了三个血友病B家系（16人）凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因外6个STR位点的多态性，并进行家系遗传连锁分析。结果成功地对家系A进行了产前诊断，6个STR位点中3个提供了遗传信息，检测出待诊胎为女性携带者。结论联合多个STR住点多态性检测是血友病B基因诊断的一种简便、快速、有效的方法。     

D13S301位点Amp—FLP分析及在Wilson病基因诊断中的应用

Ｗｉｌｓｏｎ病（ＷＤ）基因内的Ｄ１３Ｓ３０１位点为二核苷酸重复序列（ｄＧ－ｄＴ）ｎ。为了探讨该病的产前诊断方法，应用聚合酶链反应方法对４１名无关中国汉族个体和４个ＷＤ家系Ｄ１３Ｓ３０１位点的多态性进行检测，用银染聚丙烯酰胺变性胶分析扩增片段长度多态性共发现８个等位片段，杂合率为７５％，多态信息量（ＰＩＣ）为０．７８。表明Ｄ１３Ｓ３０１位点ＰＩＣ高，可以作为中国汉人的ＷＤ基因的遗传标记对ＷＤ家系进行基因诊断。     

用短串联重复序列诊断唐氏综合征

目的　建立一种准确、快速、简便的唐氏综合征 (Down's syndrome,DS)基因诊断技术。方法选择 10个位于 2 1号染色体上唐氏综合征关键区域内 (2 1q2 2 .1～ 2 1q2 2 .2 )或附近的短串联重复序列 (shrottandem repeats,STR)位点 ,应用 PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳或荧光 PCR(ABI 310 )进行 STR分型 ,根据STR位点出现 3条带图谱诊断 DS,荧光半定量的 2∶ 1带型可辅助诊断 ,并用细胞遗传学染色体核型分析进行证实。结果　在 2 0例可疑患者外周血中有 5例 DS阳性结果 ,其中 1～ 6个 STR位点呈 3条带图谱 ,其余为强度 2∶ 1的两条带型。 2 6例 DS的高危孕妇羊水细胞均未检出 3条带图谱和 2∶ 1图谱。基因诊断结果与细胞染色体核型分析一致。结论　联合进行 2 1号染色体上 10个 STR位点的基因分型 ,可准确、快速、简便地作出 DS的基因诊断 ,促进 DS产前诊断的开展 ,降低发病率。     

人类白细胞抗原A和C座位基因重组二个家系分析

目的 探讨2个家系人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)座位的重组情况.方法 采用聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针技术检测2个家系成员HLA-A、-C、-B、-DRB1和-DQB1位点,应用测序分型方法进行HLA高分辨基因分型,然后通过家系遗传分析确定HLA基因重组相关位点,检测短串联重复序列位点确定其家系成员亲权关系.结果 2个家系HLA单倍型的重组发生在HLA-A和C位点之间,家系调查显示1例为父源、1例为母源HLA单倍型发生了交换后遗传给子代,短串联重复序列结果证实2个家系成员内具有高度的亲权关系.结论 发现了2个中国汉族人群HLA-A和C基因座位间的基因重组家系,为深入研究HLA的重组机制提供了基础.     

孕妇血浆中游离胎儿DNA的检测与分析

目的 建立不依赖于胎儿性别和父本DNA、可适用于染色体数目异常和单基因遗传病的无创性产前诊断方法.方法 应用降落PCR和二次PCR扩增技术,联合检测41例正常孕妇(其中孕龄7 w 1例,14～20 w 39例,32 w 1例)血浆中游离胎儿DNA的SRY基因和D17S1293、D21S11、DXS8377等3个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点.SRY基因扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,STR位点扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色.结果 41例孕妇血浆DNA中均检出非母源性等位基因条带;联合SRY基因和X-STR位点鉴定胎儿性别,38例判断明确,3例不能明确判断性别.结论 检测孕妇血浆中的游离胎儿DNA,可快捷地获得男性胎儿和女性胎儿的父源性DNA信息,不仅适用于性连锁遗传疾病,而且适用于常染色体遗传疾病等的产前基因诊断.