反义核苷酸干预血管成形术后平滑肌细胞生长因子基因表达的研究

为了研究反义核苷酸对平滑肌细胞（ＳＭＣ）及生长因子基因表达的影响。本实验对兔髂动脉粥样硬化模型行血管成形术；应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交和ＲＴ－ＰＣＲ方法观察反义核苷酸对体外兔髂动脉ＳＭＣ增殖及转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达的影响。结果表明：反义核苷酸抑制ＳＭＣ增生，并呈浓度依赖性；反义核苷酸抑制ＴＧＦ－β１和ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达；阳离子脂质体能明显增强反义核苷酸的上述作用。在培养的兔髂动脉ＳＭＣ中ＥＧＦＲｍＲＮＡ表达阴性。结论：反义核苷酸抑制兔髂动脉ＳＭＣ增生与抑制ＴＧＦ－β１和ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达有密切关系。     

肝素干预血管成形术后平滑肌细胞生长因子基因表达的研究

目的探讨肝素影响血管成形术后动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）增生的机理。方法建立兔动脉粥样硬化模型，行血管成形术；观察肝素对体外兔髂动脉ＳＭＣ的增生、细胞周期、转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达等的影响。结果肝素能抑制ＳＭＣ的增生，并具有浓度依赖性和时间依赖性；肝素阻止ＳＭＣ进入Ｓ期，也有浓度依赖性和时间依赖性；肝素能抑制ＴＧＦ－β１和ｂＦＧＦ信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）的表达；在培养的兔髂动脉ＳＭＣ中ＥＧＦＲｍＲＮＡ的表达呈阴性。结论肝素抑制培养的兔髂动脉ＳＭＣ的增生与抑制ＴＧＦ－β１和ｂＦＧＦｍＲＮＡ的表达有密切关系。     

反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

为了解丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因调控方式、探索反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的体外抑制作用。构建了由ＨＣＶ５′非翻译区（５′ＵＴＲ）翻译启动报道基因－虫荧光素酶（ｌｕｃ）基因的真核表达载体；人工合成了针对ＨＣＶ５′ＵＴＲ及非结构蛋白５（ＮＳ５）区的反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）。借助脂质体将ＯＤＮ分别与所构建的载体一同转染人癌细胞系，短期培养后制备细胞提取液，以荧光发光法检测ｌｕｃ基因的表达．     

血管成形术后生长因子的基因表达

本实验在于观察血管成形术对生长因子基因表达的影响.本实验用球囊导管拉伤血管内膜和高脂饲养的方法建立兔髋动脉粥样硬化模型,再对模型兔进行球囊血管成形术.作者用Northern印迹同位素杂交和RT-PCR技术观察了血管成形术前后转移生长因子(TGF-β_1)、表皮生长因子受体(EGFR)和成纤维细胞生长因子碱性分子(bFGF)基因表达的情况.在血管成形术后1周和2周,TGF-β_1、EGFR和bFGF的mRNA表达较血管成形术前明显升高.血管成形术使兔髂动脉组织生长因子基因表达升高,可能与血管成形术后再狭窄有关.     

反义ras寡聚脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为了研究调控小分子Ｇ蛋白（ｒａｓ蛋白）以抑制血管平滑肌细胞对生长因子的反应机制，用合成的反义ｒａｓ寡聚脱氧核苷酸作用碱性纤维母细胞生长因子以刺激培养的大鼠血管平滑肌细胞，通过氚标胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入法及免疫组织化学方法，来观察反义ｒａｓ寡聚脱氧核苷酸对在碱性纤维母细胞生长因子刺激下的大鼠血管平滑肌细胞ＤＮＡ合成和增殖细胞核抗原的影响。结果表明：反义ｒａｓ寡聚脱氧核苷酸可明显抑制血管平滑肌细胞ＤＮ     

预防血管成形术后再狭窄的C-sis反义寡脱氧核苷酸在血清中的稳定性

目的 探讨自行设计合成的C-sis癌基因反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis癌基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(PS-AODN)血清稳定性。方法 用小牛血清模拟体内条件于不同时相点进行稳定性试验,用高效液相色谱法测定血清中AODN和FS-ODN。结果 AODN在血清中1小时内降解43.3％,1天降解53.1％。PS-ODN 1 h降解23.7％,第6天降解59.6％。PS-AODN血清中的稳定性明显高于AODN。结论 PS-AODN在血清中有较好的稳定性,提示其具有潜在的临床应用价值。     

反义ras寡聚脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为了研究调控小分子G蛋白（ras蛋白）以抑制血管平滑肌细胞对生长因子的反应机制，用合成的反斗ras寡聚脱氧核苷酸作用于碱性纤维母细胞生长因子以刺激培养的大鼠血管平滑肌细胞，通过鼠标胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入法及免疫细胞化学方法，来观察反斗ras聚脱氧核苷酸对在碱性纤维母细胞生长因子刺激下的大鼠血管平滑肌细胞DNA合成和增殖细胞核抗原的影响。结果发现，反义ras寡策脱氧核苷酸可明显抑制血管平滑肌细胞DNA的合成，作用12h和24h的抑制率分别为92％和90％；而相同浓度的正义链组仅呈现较弱的抑制作用（P＜0．01）．反义ras寡聚脱氧核苷酸亦可显著减少血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原蛋白的表达．提示该策略的应用有可能解决以生长因子为始因引起的细胞增殖性疾病、经文腔内冠状动脉成形术后再狭窄、动脉粥样硬化及高血压等问题的临床防治．     

反义c-jun表达质粒对血管平滑肌细胞表型转化标志的影响

为研究c-jun反义RNA对血管平滑肌细胞表型转化的影响,本文应用可表达c-jun反义RNA的真核细胞表达载体转染大鼠血管平滑肌细胞,采用Northern印迹、Westem印迹和氚标胸腺嘧啶核苷掺入实验,观察反义c-jun对血管平滑肌细胞表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白、平滑肌胚胎型肌球蛋白重链和骨桥蛋白表达和DNA合成的影响。结果发现,在血管平滑肌细胞中表达的c-jun反义RNA可使血管平滑肌细胞去发化标志基因平滑肌胚胎型肌球蛋白重链和骨桥蛋白mRNA表达较对照分别下降50％和95％,骨桥蛋白水平较对照下降75％,同时血管平滑肌细胞的DNA合成受到显著抑制,实验组氚标胸腺嘧啶核苷掺入值对照降低37％。c-jun反义RNA对血管平滑肌细胞分化标志基因平滑肌α－肌动蛋白的表达无明显影响。提示c-jun基因表达产物在维持血管平滑肌细胞于去分化状态中起重要作用。     

反义寡核苷酸抑制肝癌血管内皮生长因子表达

目的 探讨不同序列的反义寡核苷酸对肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制效果。 方法 SMMC7721细胞于正常氧和缺氧条件下培养24 h,观察缺氧对VEGF mRNA表达的影响;SMMC7721细胞接种于6孔板后,各加入不同的反义寡核苷酸(反帽子结构A06513、反翻译起始部位A06514、反第三外显子A06515、反翻译终止部位A06516和空白组),缺氧培养24 h,然后收集细胞提取总RNA并作逆转录聚合酶链反应分析,同时以管家基因GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)表达为内对照。 结果 缺氧条件下,SMMC7721细胞VEGF mRNA表达明显增强,而有氧条件下未见表达;反义寡核苷酸具有明显抑制VEGF mRNA表达,和空白对照组相比,A06513、A06514、A06515及A06516的VEGF/GAPDH值分别为0.49±0.08、0.71±0.12、0.72±0.11及0.86±0.12(F=12.21,P<0.05)。帽子结构的反义基因表现最强的抑制作用(P<0.0 1)。 结论 与VEGF帽子结构作用的反义寡核苷酸,有望成为肝癌反义基因治疗的新选择。     

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.     

转染血管紧张素Ⅱ受体（AT1）反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的 …

目的：评价转染ＡＴ１我核菩酸（ＡＴ１Ａ）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）血管紧张Ⅱ（ＡｎｇⅡ）受体亚型ｍＲＮＡ表达、蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）、丝裂素活化蛋白激酶Ｐ＾３８（Ｐ＾３８ＭＡＰＫ）蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用。方法：ＲＴ－ＰＣＲ克隆ＡＴ１ ｃＤＮＡ序列（４７６ｂｐ）,将克隆的ＡＴ１ ｃＤＮＡ反向插入ＰｃＤＮＡ３．１,构建一完整的含ＡＴ１Ａ的质粒（ＰＡＴ１Ａ）,测序鉴定。转染培养的大鼠ＶＳＭＣｓ     

血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸对血小板源生长因子诱导大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

为研究血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸对血小板源生长因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响和作用机制,利用激光共聚集显微镜观察平滑肌细胞对异硫氰酸荧光素标记的反义寡核苷酸的摄取和细胞内定位,改良Boden's小室法观察平滑肌细胞迁移。结果发现,加入反义寡核苷酸培养24h及48h后荧光分别位于细胞浆内和细胞核内,5umol/L以上浓度反义寡核苷酸作用36h后,被血小板源生长因子诱导迁移通过Boyden's小室碳纤维素膜的细胞数量小于空白对照组;正义,错义寡核苷酸和5umol/L以下浓度反义寡核苷酸迁移抑制不明显,提示血小板源生长因子β受体反义寡核苷酸在细胞核内呈时间和浓度依赖性抑制血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移。     

碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸抑制胰岛素诱导动脉平滑肌细胞增殖

为研究胰岛素诱导的动脉平滑肌细胞增殖作用和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷对培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞生长的影响。采用胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸处理培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞,Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ检测碱性成纤维细胞生长因子基因ｍＲＮＡ表达,并测定氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入和细胞计数。结果发现胰岛素能明显诱导平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子ｍＲＮＡ表达和增殖,且呈浓度依赖性。胰岛素浓度由０．００１ｍｇ／Ｌ增加到１．０ｍｇ／Ｌ,平滑肌细胞增殖率由１０％增加到５３％。碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸（５μｍｏｌ／Ｌ）能明显抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子ｍＲＮＡ表达和增殖,氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入被抑制４１．１％（与对照组比较,Ｐ＜０．０１）,细胞计数被抑制３０．２％（与对照组比较,Ｐ＜０．０１）。提示胰岛素可通过诱导平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子的表达而促进动脉平滑肌细胞增殖,碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸能有效抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞的ＤＮＡ合成及其增殖。     

HSP70反义寡脱氧核苷酸促进MRC-5细胞衰老的研究

目的 采用反义寡核苷酸技术了解HSP70与细胞衰老之间的关系.方法 设正义组、反义组,在转染后12,24 h,3,5 d,分别用流式细胞技术和免疫荧光技术检测HSP70蛋白水平、凋亡细胞比例和细胞周期.在转染后第2、4、6天,分别收集正义组、反义组和空白对照组细胞爬片进行SA-β-Gal染色.结果 各时间点反义组蛋白表达均低于正义组（P＜0.05）,凋亡细胞比例均高于正义组（P＜0.05）.随观察期延长,处于G1期的细胞数逐渐增多,但反义组均高于正义组（P＜0.05）.相同时间点反义组SA-β-Gal染色阳性细胞（蓝染细胞）数均较正义组和空白对照组多,随观察期延长,各组蓝染细胞均增多.结论 HSP70反义寡脱氧核苷酸下调MRC-5细胞HSP70的表达,使细胞出现G1期阻滞,促进细胞衰老.     

转染血管紧张素受体Ⅱ(AT_l)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :评价转染 ATl 反义核菩酸 (ATl A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张 (Ang )受体亚型 m RNA表达、蛋白激酶 C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶 P38(P38MAPK)蛋白表达 ,及蛋白核酸合成的作用。方法 :RT- PCR克隆 ATl c DNA序列 (476 bp) ,将克隆的 ATlc DNA反向插入 Pc DNA3.1 ,构建一完整的含 ATl A的质粒(PATl A) ,测序鉴定。转染培养的大鼠 VSMCs,RT- PCR检测转染 VSMCs AT1 m RNA表达。Ang (1 0 - 7mol/ L)剌激 2 4h后 ,比较转染与非转染的 VSMCs AT1 与 AT2 m RNA表达(RT- PCR)、P38MAPK和 PKC蛋白表达 (免疫印迹 ,westernblot)、蛋白核酸合成 (3H- L eucine及 3H- Thym idine掺入 )。结果 :成功构建 PATl A。RT- PCR显示转染 VSMCs ATlm RNA表达量显著减少 ,与对照 VSMC相比差异显著 (P<0 .0 1 )。Ang (1 0 - 7mol/ L)刺激 2 4h后 ,与非转染 VSMCs相比 ,转染 VSMCs ATl m RNA明显减少 (P<0 .0 1 ) ,AT2m RNA明显增加 (P<0 .0 1 ) ;但两组间 PKC和 P38MAPK蛋白表达 ;3H- L eu及3H- Td R掺入量均无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 :经 ATl A封闭后 ,能显著抑制 VSMC ATl m RNA表达 ,同时上调 AT2 m RNA。单纯封闭 ATlm RNA并不能有效阻断Ang 介导的 VSMCs蛋白核酸合成及 VSMCs生长相关的信号转导 ,     

卡托普利对血管成形术后血管壁血小板源性生长因子基因表达的影响

球囊拉伤血管加高脂饲养建立兔髂动脉粥样硬化模型进行球囊血管成形术，随机分为治疗组（ｎ＝８）和对照组（ｎ＝８）。治疗组于术前７天至术后第２８天每天接受卡托普利（１２．５ｍｇ／ｋｇ）治疗。术后４用处死动物．分离血管，应用斑点印迹杂交技术检测成形段血管血小板源。术后４周处死动物，分离血管，应用斑点印迹杂交技术检测成形段血管血小板源性生长因子基因及其受体基因表达。结果表明，卡托普利能抑制血管成形术后成形段血管血小板源性生长因子基因及其受体基因表达。     

凝血酶对大鼠血管平滑肌细胞血小板源生长因子受体基因表达的影响

为了研究凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源生长因子受体基因表达的影响 ,探讨凝血酶刺激血管平滑肌细胞增殖的机制 ,通过培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,用斑点杂交检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源生长因子受体mRNA的表达。结果发现培养的血管平滑肌细胞在基础状态下可表达血小板源生长因子α受体和 β受体mRNA ,凝血酶在作用于血管平滑肌细胞 2～ 12h抑制了血管平滑肌细胞血小板源生长因子α受体 β受体mRNA的表达 ,2 4～ 48h后血管平滑肌细胞血小板源生长因子α受体 β受体mRNA的表达恢复到基础状态。提示凝血酶对血管平滑肌细胞具有较强的促增殖作用 ;凝血酶显著降低了血管平滑肌细胞血小板源生长因子α受体 β受体mRNA的表达     

转染血管紧张素Ⅱ受体(AT1)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:评价转染AT1反义核菩酸(AT1A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张Ⅱ(AngⅡ)受体亚型mRNA表达、蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶p38(P38MAPK)蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用.方法:RT-PCR克隆AT1 cDNA序列(476bp),将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3.1,构建一完整的含AT1A的质粒(PAT1A),测序鉴定.转染培养的大鼠VSMCs,RT-PCR检测转染VSMCs AT1mRNA表达.AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,比较转染与非转染的VSMCs AT1与AT2 mRNA表达(RT-PCR)、P38MAPK和PKC蛋白表达(免疫印迹,western blot)、蛋白核酸合成(3H-Leucine及3H-Thymidine掺入).结果:成功构建PAT1A.RT-PCR显示转染VSMCs AT1 mRNA表达量显著减少,与对照VSMC相比差异显著(P＜0.01).AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,与非转染VSMCs相比,转染VSMCs AT1 mRNA明显减少(P＜0.01),AT2 mRNA明显增加(P＜0.01);但两组间PKC和P38MAPK蛋白表达;3H-Leu及3H-TdR掺入量均无显著性差异(P＞0.05).结论:经AT1A封闭后,能显著抑制VSMC AT1mRNA表达,同时上调AT2 mRNA.单纯封闭AT1 mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的VSMCs蛋白核酸合成及VSMCs生长相关的信号转导,其他信号通路可能有代偿作用.     

血小板源生长因子和血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中p57基因表达的影响

为观察血小板源生长因子BB和血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞p57蛋白和基因表达的影响及其在血管平滑肌细胞增殖增生中的作用。用贴壁法培养鼠胸主动脉平滑肌细胞,加入血小板源生长因子BB 20ug/L或血管紧张素Ⅱ 1umol/L刺激24h,用Western蛋白印迹法检测p57蛋白水平,用DNA芯片技术检测p57 mRNA的表达量,结果发现,血小板源生长因子BB刺激组p57 mRNA和p57蛋白表达量明显高于血管紧张素Ⅱ刺激组,分别为后者的2．47倍和1．7倍,而血管紧张素Ⅱ刺激组p57蛋白表达量与对照组接近,保持在较低水平,研究结果提示,在血小板源生长因子刺激引起的血管平滑肌细胞增殖过程中p57基因表达明显增高,p57基因的高表达可能起抑制血管平滑细胞过度增殖的作用。