重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在体内外的表达

目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF-I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.方法应用PCR方法从人肝细胞cDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列,克隆入T载体pMD18中,经测序证实序列正确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性.结果经测序证实,目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增;构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实,hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中.结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF—I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。方法应用PCR方法从人肝细胞eDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列，克隆人T载体pMDl8中，经测序证实序列正确后，进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性。结果经测序证实，目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增；构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实，hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中：结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。     

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的：构建LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法：RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白－２（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,并构建pIRES2-EGFP-LMP－1及pIRES2-EGFP-BMP－2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP－1、pIRES2-EGFP-BMP－2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果：pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论：LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性.方法 利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP.行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应.结果 经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2-EGFP的多克隆位点上;建立Cre( )组(pCMV-Cre-EGFP和含Loxp-CMV-RFP-Loxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48 h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre( )组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P＜0.01).结论 成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在仓鼠体内及COS-7细胞中的表达

目的：构建猪源性CCK基因重组真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK（CCK pDNA），研究其在哺乳动物细胞和仓鼠体内的表达。方法：以限制性内切酶法从中介载体pMD18-T／CCK中切取目的片段CCK，将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，以脂质体法转染COS-7细胞，同时采用直接肌肉注射法免疫仓鼠，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果：用CCKpDNA转染COS-7细胞后24，48，72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达，其中72h组荧光强度达到最强。用CCK pDNA免疫仓鼠后，第4天注射部位可检测到绿色荧光蛋白的表达，第14天荧光强度明显增强，第42天荧光强度进一步增强，正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK，并成功地在哺乳动物细胞和仓鼠体内进行了表达，为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

携带IRES的hBDNF绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定

目的构建表达人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因的真核细胞表达载体,并且观察重组质粒在真核细胞中的表达情况。方法采用PCR方法从健康人基因组中扩增出该基因,将hBDNF的PCR产物用XhoⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到用XhoⅠ和SalⅠ双酶切的带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中。对重组质粒进行双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组的质粒转染至真核细胞中,用RT-PCR和荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况。结果双酶切和质粒测序结果证明hBDNF已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,质粒能在细胞中正常表达。结论成功构建了EGFP/hBDNF表达载体,为应用hBDNF治疗中枢神经系统疾病奠定坚实的基础。     

同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程载体的实验研究

目的通过体外同种异体脱钙骨基质（DBM）和骨髓基质细胞（BMSC）的复合培养及体内异位成骨实验，研究DBM作为骨组织工程载体的生物相容性及成骨活性。方法参考Urist操作方法大量制备兔同种异体DBM。骨穿取兔骨髓单细胞悬液进行培养，将BMSC与同种异体DBM体外复合培养3～7d，相差显微镜、扫描电镜（SEM）和苏木精-伊红染色后光镜下观察结果。将DBM和BMSC复合培养3d的复合物植入家兔一侧骶棘肌肌袋内，分别在1、2、4周活体取材，扫描电镜和苏木精-伊红染色后光镜观察，对侧单纯植入DBM作为对照。结果体外培养发现BMSC在DBM中贴壁生长、增殖并有分泌活动。体内实验发现BMSC在DBM孔隙内均匀成骨，对照组则从DBM骨块的边缘到中心逐步成骨，成骨所需的时间长，而且成骨量要小于前者。结论DBM作为组织工程载体具有良好的生物相容性和成骨活性。     

自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞治疗兔感染性骨缺损的实验研究

目的探讨自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞治疗感染性骨缺损的效果,为临床应用提供实验依据。方法将24只新西兰白兔制成双侧桡骨中段1cm的感染性骨缺损,随机分为两组,分别植入自体微小颗粒骨、自体微小颗粒骨与骨髓间充质干细胞,于术后2、4、8、12周行X线及组织学检查,并行Lane-sandhu评分。结果术后2、4、8周自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞移植组X线评分及组织学评分高于自体微小颗粒组(P﹤0.05);术后第12周两组X线及组织学评分差别无统计学意义(P>0.05)。结论自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞修复感染性骨缺损的能力优于自体微小颗粒骨移植。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

人股骨头制作的脱钙骨基质和脱蛋白骨成骨诱导活性比较

目的比较人无菌性坏死股骨头制作的脱钙骨基质（DBM）和脱蛋白骨（DPB）的体外成骨诱导活性。方法将人股骨头制作成的DBM和DPB与人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）复合培养,并以单层细胞为对照组。检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）和钙离子（Ca2＋）的浓度。结果两种材料均表现出成骨诱导活性,DBM材料组的ALP、OC和Ca2＋浓度均明显高于DPB组和对照组,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论DBM和DPB均具有成骨诱导活性,且DBM的成骨诱导活性更强。     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

陶瓷样异种骨对骨髓基质细胞生长及附着影响的实验研究

目的：探讨陶瓷样异种骨(CXB)与骨髓基质细胞的生物相容性，为CXB复合骨髓移植修复骨缺损提供依据．方法：将理化处理制得的陶瓷样异种骨(CXB)与兔骨髓基质细胞体外复合培养，用倒置相差显微镜及扫描电镜观察CXB对骨髓基质细胞的形态、生长、附着及增殖的影响．结果：CXB对骨髓基质细胞的形态、生长、附着及增殖均无不良影响，显示出良好的生物相容性．结论：CXB具有良好的生物相容性，可望与骨髓复合移植修复骨缺损．     

深冻同种异体骨移植联合骨髓单核细胞移植治疗骨肿瘤性骨缺损

目的：评价骨肿瘤病变切除后应用深低温冷冻同种异体骨移植联合自体骨髓单核细胞移植修复骨缺损的治疗效果;方法：回顾性分析2004年1月至2009年1月在我院骨科骨肿瘤病变的124例患者,其中采用同种异体骨联合自体骨髓单核细胞移植植骨61例（联合骨髓单核细胞移植组）;单纯同种异体骨植骨63例（单纯植骨组）;结果：联合骨髓单核细胞移植组移植骨界限模糊时间和消失时间均短于单纯植骨组。术后6、12、24个月时联合骨髓单核细胞移植组骨密度明显高于单纯植骨组。结论：同种异体骨联合自体骨髓单核细胞移植,组织抗原性减弱,能明显促进骨融合和骨缺损的愈合。     

诱导成骨修复家兔桡骨缺损的实验研究

定性、定量地了骨基质明胶和脱钙骨基质与自体红骨髓复合植入物修复家兔桡骨损的过程。结果表明两者均有诱导成骨作用，骨基质明胶的诱导成骨能力优于钙骨基质。术后６周，骨基质明胶组的骨缺损已完全愈合，而脱钙骨基质组接近愈合。作者认为含有骨形态发生蛋白的骨基持明胶和脱钙骨基质具有诱导成骨能力，而自体红骨髓为骨形态发生白提供诱导成骨的靶细胞。     

红斑汤对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠外周血细胞及骨髓细胞CD34、CD45表达的影响

目的：探讨红斑汤对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠外周血及骨髓细胞CD34、CD45表达的影响。方法：除正常组外,其余各组给以环磷酰胺25 mg·kg^-1,隔日1次,腹腔注射2次即可造成骨髓抑制模型,正常组以生理盐水代替。观察红斑汤对小鼠外周血细胞及骨髓细胞CD34、CD45的影响。结果：与正常组相比,模型组小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板及骨髓细胞CD34、CD45均可见降低,差异有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）;红斑汤组及鲨肝醇组小鼠外周血中白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板与模型组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,可以认为红斑汤组与鲨肝醇组,具有促进骨髓抑制小鼠白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板的恢复,且鲨肝醇组疗效不显著优于红斑汤组（P〉0.05）;红斑汤组和鲨肝醇组骨髓细胞CD34、CD45及CD34、CD45的双阳性率也明显高于模型组,差异有统计学意义（P〈0.05）,说明红斑汤组和模型组均能促进骨髓细胞CD34、CD45的恢复,且鲨肝醇组不优于模型组（P〉0.05）。结论：红斑汤具有升高骨髓抑制小鼠外周血中白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板及骨髓细胞CD34、CD45;具有改善环磷酰胺对小鼠骨髓抑制的作用。     

大段同种异体骨移植在骨肿瘤性骨缺损修复中的应用

目的探讨大段深冻同种异体骨及异体半关节移植在治疗四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损中的疗效。方法1993年6月～2003年12月应用大段深冻同种异体骨及异体半关节移植治疗四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损患者53例，年龄13～58岁，平均36，5岁，其中大段骨移植45例，异体半关节移植8例，异体骨移植长度9～25cm，平均13cm。钢板固定23例，动力髋（或动力髁）固定12例，交锁髓内钉固定12例，普通髓内钉固定6例。结果随访资料完整者48例，术后随访6～132个月，平均38个月，异体骨愈合45例，不愈合3例。主要并发症：复发3例，骨不连3例，感染2例（后治愈），骨折2例，内固定失败1例。关节功能按Mankin标准评定；优18例，良15例，中9例，差6例。结论大段深冻同种异体骨及异体半关节是四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损较为理想的修复材料。