致血流感染非O1群非O139群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

目的对襄阳市中心医院分离1株疑似霍乱弧菌进行鉴定及药物敏感性试验,并检测其主要毒力基因。方法利用MicroScan WalkAway 40鉴定仪进行生化鉴定及药物敏感性试验,玻片凝集法确定其血清型别,应用PCR及测序技术分析其16SrRNA基因;PCR检测其6个毒力基因。结果经鉴定,该株疑似霍乱菌株为非O1群非O139群霍乱弧菌,经16SrRNA分析与美国国家生物技术信息中心数据库中霍乱弧菌相似性达100%。药敏试验结果显示该菌对氨苄西林、氯霉素、甲氧苄啶-磺胺甲（口恶）唑、四环素均敏感,毒力基因检测rtxC和toxR阳性,tcpAET、ctxA、hlyA、tcpACL阴性。结论该株疑似霍乱弧菌为非O1群非O139群霍乱弧菌,其致病与rtxC、toxR毒力基因有关。     

山西省从粪便中分离到产霍乱毒素的拟态弧菌

目的从山西省霍乱样粪便中分离到拟态弧菌,并检测其是否携带霍乱毒素基因。方法采集患者粪便、患者家用自来水、金鱼和鱼缸水标本,按照WS289-2008和《霍乱防治手册》(第5版)方法 ,对标本进行增菌和选择性培养基的分离培养,疑似菌落以霍乱弧菌血清凝集试验检测,并用API20E系统鉴定菌种。同时,疑似菌落用PCR检测O1、O139群特异性和是否携带霍乱毒素基因。结果粪便标本经增菌后接种选择性培养基,在庆大琼脂和碱性琼脂上均有霍乱弧菌疑似菌落,但在TCBS琼脂上为绿色、透明、中等大小、光滑、湿润的菌落;血平板上可见灰白色、湿润菌落,有透明溶血环;染色镜检湿片暗视野下未见流星状运动细菌。氧化酶和粘丝实验阳性,霍乱弧菌O1、O139群血清凝集试验阴性。菌株经API20E鉴定为拟态弧菌(93.5%可能性)。环境标本中未分离和检测到拟态弧菌。PCR检测该拟态弧菌中携带霍乱毒素基因,而O1、O139群特异性为阴性。结论从急性霍乱样腹泻粪便中分离到1株拟态弧菌,对于临床类似霍乱样症状的病例标本,当病原的霍乱弧菌血清凝集为阴性时,应进一步做霍乱毒素的检测。     

福建省漳州市海、水产品霍乱弧菌污染状况调查分析

目的查明福建省漳州市海、水产品霍乱弧菌污染状况及菌型特征。方法 2008年5-10月采集养殖场及市场、餐厅销售的海、水产品,用涂抹法对其体表、腮部和泄殖腔取样后,直接接种于碱性蛋白胨水进行增菌,划线接种庆大琼脂平板分离培养。取纯培养物进行染色镜检,用霍乱弧菌混合多价、O139群及单价分型诊断血清做玻片凝集试验,阳性菌株进一步做试管凝集及系统生化鉴定;使用常规PCR检测霍乱弧菌肠毒素ctxA基因。霍乱弧菌检出率的比较用χ2检验。结果漳州市海、水产品霍乱弧菌带菌率为5.08%(26/512),其中小川型15株、稻叶型11株。蛙类带菌率最高为25.00%(13/52)。ctxA基因检测均为阴性。增菌6～8 h霍乱弧菌检出率为0.78%、增菌18～24 h为2.34%,两种增菌时间霍乱弧菌检出率的比较差异有统计学意义(P0.05);第一次增菌霍乱弧菌检出率为2.34%、第二次为5.08%,两次增菌霍乱弧菌检出率的比较差异有统计学意义(P0.05)。结论漳州市海、水产品存在霍乱弧菌污染,需采取相应的预防措施防止霍乱疫情的发生。本次通过对染菌样品培养条件进行对比实验证明,染菌样品最适增菌时间应为18～24 h并宜二次增菌。     

血清凝集、基因测序联合检测群霍乱弧菌的应用

目的 避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。方法 随机选取2013年1～7月,全国各省市CDC送往中国CDC霍乱初筛阳性菌株14株; 用LB营养琼脂培养12 h,挑取单菌落进行霍乱弧菌血清凝集,同时水煮模板法提取菌株的DNA。针对弧菌属16SrDNA序列设计引物,进行弧菌16SrDNA PCR检测,电泳观察16SrDNA产物,将16SrDNA阳性产物送测序公司测序,测序结果在NCBI网站上进行Blast比对,分析比较血清凝集和Blast比对结果。结果 共选取14株菌进行实验,血清凝集阳性12株,2株未凝。经弧菌16SrDNA扩增,电泳观察14株菌均扩增出相应的片段,说明所选菌株均为弧菌属。将14株菌的16SrDNA阳性产物测序,并将测序结果进行Blast比对:2株血清未凝集菌均是哈维氏弧菌; 12株血清凝集阳性的菌中,1株是需钠弧菌,其余11株是霍乱弧菌。结论 血清凝集和基因测序联合检测群霍乱弧菌,可避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。     

小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型特异性单克隆抗体的制备

目的 利用杂交瘤技术制备小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型特异性单克隆抗体,用于小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型菌株的分型鉴定.方法 用小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型菌株作为抗原,以骨髓杂交瘤细胞融合技术制备小肠结肠炎耶尔森单克隆抗体,用玻片凝集筛选法进行单克隆抗体的特异性鉴定.结果 筛选到1株与小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型菌株呈现阳性反应,并与日本的抗血清检测结果相一致,而与被检测的其他血清型小肠结肠炎耶尔森菌和常见肠道致病菌无交叉凝集反应.结论 本实验筛选获得的单克隆抗体,用于小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型菌株鉴定,具有良好的特异性,避免了免疫血清难以避免的交叉凝集现象.     

一起引起食物中毒的非O1群霍乱弧菌实验室鉴定

目的 查明引发浙江省宁波市某服饰公司食物中毒事件的病原菌.方法 对采集到可疑食品和肛拭等标本参照GB/T4789-2003标准进行细菌的分离、鉴定及血清学分型;参照霍乱防治手册检测菌株的CT毒力基因.结果 6份患者大便标本与14份轻微腹泻患者或腹部不适者大便标本中检出非O1群霍乱弧菌O29血清型9株,其中腹泻患者标本检出6株,轻微腹泻患者中检出3株,检出率为45.0%.未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌,剩余食物未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌.结论 此次食物中毒为非O1群霍乱弧菌O29血清型所致.     

API 20E和20NE对弧菌属细菌的鉴定分析

我们在实际工作中发现 ,API2 0E和 2 0NE对弧菌属某些细菌的鉴定易产生错误结果。为此 ,我们以非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河弧菌分别接种API 2 0E和2 0NE试条 ,分析其鉴定结果 ,寻找鉴定失败的原因及处理方法 ,并根据各菌生化反应 ,建立一套API鉴定系统与常规方法相结合的鉴定方法。1　材料和方法1 .1　菌株来源　非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河弧菌各 1株系卫生部和浙江省临床检验中心的室间质评菌株。1 .2　培养基　克氏双糖铁琼脂、4号琼脂、蔗糖和水杨苷微量发酵管、0和 6 0g/L氯化钠胨水均购自杭州天…     

广州市一起非O1/O139群霍乱弧菌食物中毒分离株的病原特征分析

目的 了解2014年广州市某工厂发生的一起非O1/O139群霍乱弧菌食物中毒分离株的耐药特性及分子特征。方法 对分离到的6株非O1/O139群分离株进行生化鉴定、血清学鉴定、药物敏感性实验、毒力相关基因检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型分析。结果 6株分离株经生化鉴定、血清学鉴定为非O1/O139群。药物敏感性分析显示,6株分离株均对氨苄西林、头孢克肟、头孢拉定、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素和多粘菌素B耐药,对诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、四环素、吡哌酸、红霉素和氯霉素敏感。毒力基因聚合酶链反应检测结果显示,所有菌株均携带毒力表达调控基因（toxR）和溶血素基因（hlyA）,未检出霍乱肠毒素基因（ctxA）、毒力协同调节菌毛基因（tcpA）和肠毒素基因（ST）;5株病例分离株和1株冷柜内壁分离株经限制性内切酶NotⅠ消化后的PFGE图谱为同一型别。结论 此次食物中毒的病原体为非O1/O139群霍乱弧菌,具有共同的遗传特征,菌株出现了多重耐药,提示应加强该类菌株的监测,防止大范围扩散或暴发流行。     

1例白血病患者血液中检出非O1非O139群霍乱弧菌

2012年8月,浦东新区儿童医学中心从1名6岁急性淋巴细胞性白血病复发患儿血液中分离到霍乱弧菌,随后浦东新区疾病预防控制中心对该分离株进行了系统生化鉴定、毒力基因及药物敏感性检测,结果为不产霍乱毒素的非O1非O139霍乱弧菌。     

1株非O1群非O139群霍乱弧菌的错误鉴定和原因分析

<正>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是弧菌科弧菌属中具有相似生化性状、相同鞭毛抗原、不同菌体抗原的弧菌的统称,按照菌体脂多糖抗原的不同,已分离出200余个血清群[1],除O1群和O139群的产毒株会导致霍乱的大流行外,其他非O1群非O139群霍乱弧菌亦可引起感染性腹泻、败血症等[2]。本研究从我院收治的1例腹泻患者粪便标本中分离培养到1株非O1群非O139群霍乱弧菌,然而布鲁克基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Bruker BioT yperTMMALDI-TOF MS)仪却错误鉴定为易北河弧菌(Vibrio albensis)。报道如下。     

江苏省环境来源的O139群霍乱弧菌的核酸特征分析

目的 分析江苏省2003-2005年之间从环境样本中分离到的霍乱弧菌的核酸特征,及其差异的程度.方法 将11株目的菌株的表型特征(包括血清型,耐药谱,生化特征以及El Tor霍乱弧菌的噬菌体分型)和核酸特征(包括霍乱毒素基因ctx-A、zot、ace、tcp-A的分布情况和脉冲场凝胶电泳指纹图谱)结合起来进行比较和分析.结果 11株菌株中有10株O139群霍乱弧菌,1株El Tor小川;其中6株O139同时对5种以上抗生素耐受,2株O139对4种抗生素耐受,1株0139对2种抗生素耐受,另外1株O139(属于PFGE-C型)和1株小川分别只对一种抗生素耐受;11株霍乱弧菌的生化特征没有明显差异;8株O139同时携带4种毒力相关基因,1株0139只携带zot和ace,另外1株O139(05052)和1株小川未携带这4种基因;9株O139的脉冲场凝胶电泳指纹图谱聚为一类,另外1株O139和小川各自聚为一类.结论 10株O139中有1株(属于PFGE-C型)的耐药谱、毒力相关基因分布及PFGE指纹图谱与其他9株不同,而与分离地点相同的小川相似,提示自然环境中的O139群霍乱弧菌存在着差异.     

浙江省非O1、非O139群霍乱弧菌快速检测与毒力基因研究

目的 建立一种快速检测非O1、非O139群霍乱弧菌方法,并对浙江省部分地区海水产品中非O1、非O139 群霍乱弧菌及其携带毒力基因开展快速检测.方法 采用三糖斜面、氧化酶实验、粘丝实验、无盐胨水等简单生化进行初筛,对全部结果阳性的菌株用聚合酶链反应(PCR)方法检测霍乱弧菌外膜蛋白OmpW以及毒力基因ctxA、hl...     

甲鱼及养殖水中5株带毒力基因O1群霍乱弧菌的分离与鉴定

目的监测杭州市江干区水产品中O1群和O139群霍乱弧菌并对分离菌株进行病原学鉴定及分子分型。方法按《霍乱防治手册》第5版对51份样品进行霍乱弧菌分离与鉴定。运用改良Kirby-Bauer纸片法和PCR检测5株霍乱弧菌对14种临床常用抗生素的敏感性及是否携带ctxA和tcpA毒力基因,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果从51份样品中检出O1群霍乱弧菌5株,其中小川型4株,稻叶型1株。5株霍乱弧菌的ctxA和tcpA毒力基因结果均为阳性。5株菌株对11种抗生素敏感,对红霉素和利福平中介,稻叶型菌株对氨苄西林敏感,小川型菌株对其耐药。PFGE分为两型,两型间仅有一条带的差异。结论本次分离的5株O1群霍乱弧菌均携带ctxA和tcpA毒力基因,故有必要加强对水产品尤其是甲鱼的监测及管理。     

利用脉冲场凝胶电泳及核糖体分型技术对14株上海崇明地区O139群霍乱弧菌分型分析

目的 对14株上海市崇明地区2005年O139群霍乱弧菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)及核糖体分型分析。 方法 用PFGE、核糖体分型对霍乱弧菌进行分析。 结果 14株O139群霍乱弧菌产毒株经核糖体分型分析为同一型;而PFGE双酶切分型结果为其中10株为同一型,其余4株为高度同源性。 结论 上海市崇明地区2005年流行的O139群霍乱弧菌核酸指纹分型基本一致。     

我国霍乱弧菌毒力协同调节菌毛基因序列分析

目的对我国霍乱弧菌（VC）毒力协同调节菌毛（tcpA）基因进行序列分析.方法 38株VC的tcpA基因经聚合酶链反应扩增、测序和序列分析.结果 13株O139群VC产毒株和15株EVC产毒株（均为流行株）的tcpA类型与EVC标准株N16961为同一类型,共有4个位点碱基发生变异,分为5个亚型.EVC流行株中2 株非产毒株的tcpA类型,1株同N16961,1株为新类型.6株EVC非流行株均为非产毒株,分为2种新类型.2株非O1非O139群VC均为非产毒株,为2种新类型.4种新类型与国外4种类型基因和氨基酸序列比较,同源性为63.8%～84.6%和60.6%～91.7%,趋异性为17.8%～44.6%和8.8%～45.8%,tcpA基因所在的VPI毒力岛的结构是完整的,但部分基因存在一定变异.结论 O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株,然后再进一步分化;在非产毒VC中发现4种新类型tcpA基因.     

2005-2014年上海市O139群霍乱弧菌的分子特征和耐药性研究

目的 分析2005-2014年上海市O139群霍乱弧菌的分子特征和耐药性。方法 以聚合酶链反应(PCR)方法检测86株O139群霍乱弧菌的霍乱毒素基因(ctxA)、溶血素基因(hlyA)、毒素协调菌毛基因(tcpA)、调控蛋白基因(toxR)和编码霍乱毒素基因的CTX基因组基因(zot、ace)。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对O139群霍乱弧菌菌株进行分子分型。采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对O139群霍乱弧菌菌株进行11种抗菌药物(头孢曲松、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、丁胺卡那霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、氨苄西林、庆大霉素)敏感试验。结果 患者来源O139群霍乱弧菌菌株93.2%(41/44)为产毒株,水产来源菌株58.3%(21/36)为产毒株,6株水体来源菌株均为非产毒株。PFGE分析将O139群霍乱弧菌分为35个型别。MLST分析将O139群霍乱弧菌分为9个ST型,其中流行菌型为ST 69型,非产毒株以ST 162型为主。86株O139群霍乱弧菌经药物敏感试验分析显示O139群霍乱弧菌产毒株的耐药情况比非产毒株严重。O139群霍乱弧菌产毒株对强力霉素、复方新诺明、四环素、萘啶酸、氨苄西林、庆大霉素的耐药率高。O139群霍乱弧菌非产毒株对萘啶酸耐药严重。结论 上海市患者和水产来源O139群霍乱弧菌构成以产毒株为主。PFGE分型提示水产为霍乱疫情的主要传染源。O139群霍乱弧菌产毒株高度克隆化,流行菌型为ST 69型,耐药情况严重。     

临床分离非O1/O139群霍乱弧菌毒力及耐药特征分析

目的 了解临床分离的非O1/O139群霍乱弧菌毒力及耐药特征。方法 收集2014-2015年北京友谊医院4-10月肠道门诊分离到的非O1/O139群霍乱弧菌,采用微量肉汤稀释法检测霍乱弧菌对15种抗生素的耐药性;PCR检测霍乱弧菌的毒力相关基因。结果 35株非O1/O139群霍乱弧菌对复方新诺明的耐药率(40.0%)最高,其次是氯霉素(28.5%)和磺胺异恶唑(22.6%),对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢西丁、头孢吡肟及亚胺培南完全敏感。毒力基因检测显示所有菌株均携带hlyA和ompU,hapA(97.1%)、rtxA(91.4%)、Ⅵ型分泌系统T6SS(94.3%~97.1%)、Ⅲ型分泌系统T3SS(80.0%~85.7%)和nanH(62.9%)阳性率较高;主要的毒力基因型为hlyA-rtxA-hapA-ompU-nanH-vasA-vasK-vasH-vcsC-vcsV-vcsN-vspD(40.0%)。结论 临床分离非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因多样化,对抗菌药物耐药性较高,需加强腹泻病例中非O1/O139群霍乱弧菌的毒力及耐药监测。     

产色素O139群霍乱弧菌环境分离株的亲缘关系分析

目的 筛检霍乱弧菌O139血清群产褐色色素的环境分离菌株并分析其遗传近缘关系。 方法 在LBA平板上检测了1992-2010年分离保存的全国1530株O139群霍乱弧菌的色素产生能力,对其中能够产生水溶性褐色色素的菌株的马尿酸氧化酶基因VC1345进行测序,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多基因序列分型分析色素产生菌株之间的亲缘关系。 结果 筛选到不同年份不同地区的16株产色素的非产毒O139群菌株。所有的色素产生菌株具有完全一致的VC1345基因、相似的PFGE带型,多基因序列分型显示仅有2种型别。 结论 分离到的O139群产色素菌株来源于近缘的克隆群,而这些菌株之间已存在一定程度的变异。在水体中的持续存在显示其较强的环境生存能力,这些特征提示在霍乱弧菌的环境监测中需提高对这类菌株的关注。     

广东省霍乱病例与环境来源霍乱弧菌的

目的比较分析广东省霍乱病例及环境来源O1/O139群霍乱弧菌抗生素敏感性和分子分型特征。方法选取2006-2007年广东省霍乱病例及相关来源、环境（珠江水体和海水产品）来源的O1/O139群霍乱弧菌。采用血清学、药物敏感性试验和分子生物学方法,研究不同来源的霍乱弧菌在菌型分布、药物敏感性、毒素基因携带以及分子分型方面的异同。结果2006-2007年,广东省共分离各类来源O1/O139群霍乱弧菌170株。其中,病例及相关来源菌株37株,环境来源菌株133株（海水产品来源37株、珠江水体96株）。两种来源菌株的菌型构成均以O1群El Tor稻叶型为主;病例及相关来源菌株以产毒株为主,ctxA毒素基因携带率（83.8%）显著高于环境菌株（4.5%）;药物敏感性试验显示,以产毒株为主的病例及相关来源菌株对萘啶酸和复方新诺明的耐药率（78.8%,78.8%）高于以非产毒株为主的环境来源菌株（50.6%,13.9%,P0.05）。环境来源菌株对多西环素的耐药率（17.7%）高于病例及相关来源菌株（0%,P0.05）。O139群菌株对氨苄西林的耐药率（70%）高于稻叶型和小川型菌株（8.9%,0%,P0.01）。脉冲场凝胶电泳（PFGE）聚类分析显示,O139群霍乱弧菌产毒株之间,O1群霍乱弧菌流行株之间以及其他的O1/O139群霍乱弧菌之间,PFGE型别表现为明显的遗传多样性。结论广东省O1/O139群霍乱弧菌来源复杂多样,霍乱防控形势严峻,需要密切注意菌株型别变异情况及菌株变异趋势。