应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型

目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析４０株结核分支杆菌临床分离株和１５例临床标本的ｒｐｓＬ基因突变的部位和性质。结果：１０株药物敏感株的ｒｐｓＬ双链泳动正常、并可被ＭｂｏⅡ消化;３０株耐ＳＭ分离株中,２５株双链泳动异常,２４株不被消化;１５例临床标本中,常规ＰＣＲ扩增７例ｒｐｓＬ阳性,巢氏ＰＣＲ１５例均阳性,４例ｒｐｓＬ双链泳动异常、并不被ＭｂｏⅡ消化。结论：通过常规ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可快速检测结核分支杆菌耐ＳＭ分离株４３位密码子点突变,而通过巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。     

结核分支杆菌耐多药株katG突变SSCP技术检测的研究

目的 建立并评价ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌耐药性基因突变的方法。方法 根据ｋａｔＧ基因易变区设计一对引物,ＰＣＲ扩增,产物经沸点断裂成单链,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,比较电泳的位置。结果 ＰＣＲ检测结核菌ＤＮＡ的灵敏度达到１００个细菌／ｍｌ,与其它细菌和其他分支杆菌无交叉反应。３０株敏感株和Ｈ３７Ｒｖ的ＰＣＲ产物经ＳＳＣＰ检测正常,２０株耐异烟肼结核菌中,１９株的ＰＣＲ产物ＳＳＣＰ检测游异常电泳带     

结核分支杆菌rpoB基因突变和耐利福平的相关性研究

研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。结果显示ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因为属特异性。８１株结核分支杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ图谱与Ｈ３７Ｒｖ为对照,３５株敏感菌仅有一株位置有区别;４６株耐药菌有４２株有明显区别;检测阳性率为９１．３％;特异性９７．１％。证明ｒｐｏＢ基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理,ＰＣＲ—ＳＳＣＰ可简便快速地检出ｒｐｏＢ基因的突变,有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

应用巢氏PCR—RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉？…

目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析４０株结核分支杆菌临床分离株和１５例临床标本的ｒｐｓＬ基因突变的部位和性质。结果：１０株药物敏感株的ｒｐｓＬ双链泳动正常、并可被ＭｂｏⅡ消化;３０株耐ＳＭ分离株中,２５株双链泳动异常,２４株不被消失;１５例临床标本中,常规ＰＣＲ扩增７例ｒｐｓＬ阳性,巢氏     

应用套式PCR检测嗜肺军团杆菌的实验研究

应用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测１￣６型嗜肺军团杆菌，两轮ＰＣＲ都分别出现了９９６ｂｐ和６５０ｂｐ的特异性扩增产物；而金黄色葡萄球菌等七种细菌均未出现特异性扩增。两轮ＰＣＲ分别可以检测１０ｐｇ和１０ｆｇ的模板ＤＮＡ。８份嗜肺军团杆菌含量分别为１￣１０＾７ｃｆｕ／ｍｌ的痰感染模拟标本均出现了特异性扩增产物。提示该方法可用于临床，特别是检测含微量嗜肺军团杆菌的临床标本。     

用巢式聚合酶链反应在牙斑中检出幽门直菌

用互补于幽门杆菌（ＨＰ）尿素酶Ａ基因片段的两对引物，建立了巢式聚合酶链反应（Ｎ－ＰＣＲ）３检测ＨＰ的方法。检测１株ＨＰ标准菌株、２０个ＨＰ临床分离株均阳性，而１２种常见肠道菌均阴性，特异性１００％，敏感性达到可检测０．１ｆｇ细菌ＤＮＡ的水平。２９例行胃镜检查者，采集其牙斑和胃粘膜标本，对胃粘膜分别做细菌培养，尿素酶试验、组织学检查和Ｎ－ＰＣＲ，前３种方法检查２１例ＨＰ阳性，８例ＨＰ阴性，Ｎ－ＰＣＲ     

用多元PCR检测老年患者院内肺部感染的病原

对３０例老年院内肺部感染患者的痰标本分别进行多元ＰＣＲ、一元ＰＣＲ和常规培养检测绿脓杆菌、流感杆菌和肺炎链球菌。结果表明：（１）多元ＰＣＲ的检测结果与一元ＰＣＲ的完全一致，但前者更快速、简便；（２）ＰＣＲ阳性检出率为６６．６７％（２０／３０），细菌培养的为３３．３３％（１０／３０），二者差异显著（Ｐ〈０．０１）。说明多元ＰＣＲ特异性好，敏感性强，比一元ＰＣＲ尤其是细菌培养大大节省时间，更适合检测混     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌

目的：建立双重ＰＣＲ技术快速鉴定的结核与非结核分支杆菌。方法：通过试验选择双重ＰＣＲ最佳反应条件,检测引物Ａ１,Ａ２和Ｂ１,Ｂ２扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对３４例结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果：引物Ａ１,Ａ２能扩增所试２４种分支杆菌,Ｂ１,Ｂ２仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增１２种非分支杆菌均为阴性。     

用聚合酶链反应快速检测痰液中结核杆菌

本研究以结核杆菌染色体中重复出现的长度为１２３个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的模板，合成一对寡核苷酸引物。痰液标本先经三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）和三硝基甲苯（Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００）加热、震荡处理，裂解结核杆菌，再作ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳。同时，与痰液直接涂片、抗酸染色镜检抗酸染色阳性杆菌作比较。用该ＰＣＲ检测的检出率为９１．４％（３２／３５），而涂片抗酸染色的检出率仅为３４．３％（１２／３５）。两者相比有非常显著性差异（ｘ２＝２４．４７６，Ｐ＜０．００１）。由于改进了ＰＣＲ前痰液标本的处理方法，使整个ＰＣＲ检测过程所需时间缩短至９ｈ。我们认为该ＰＣＲ检测结核杆菌是特异、敏感和快速的，可在临床实验室应用。     

逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

结核分枝杆菌耐药基因检测

目的：研究结核分枝杆菌耐药的分子机制，建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应、ＰＣＲ－单链构象多态性、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析ＭＴ临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ＫａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果：ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－１０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ经物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的种特异性。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ与Ｐ     

简易菌落斑点杂交法快速检测志贺氏菌ipaH基因的实验研究

采用ＰＣＲ扩增技术，制备了Ｄｉｇ标记志贺氏菌多拷贝的ｉｐａＨ基因探针。用该探针通过菌落斑点杂交试验，探索快速、特异、敏感、简单检测志贺氏菌的方法。本法检测灵敏度达５－１０ｐｇＤＶＡ／μｌ。含菌量为３×１０６ＣＦＵ／ｍｌ的粪便上清液直接抽滤点膜２５μｌ杂交结果为阳性。与经ＰＣＲ扩增测定的５０株细菌（其中ｉｐｔａＨ基因阳性菌２５株，阴性菌２５株）进行比较，菌落斑点杂文结果与ＰＣＲ扩增结果完全一致。全部实验可在２０ｈ内完成。     

套式聚合酶链反应及限制酶分析对孕早期孕妇巨细胞病毒感染的研究

在人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）－ＡＤ１６９株直接早期基因的ＥｃｏＲＩＪ片段内，自行设计二对引物，建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制酶分析检测ＨＣＭＶＤＮＡ，经实验证明有高度的特异性与敏感性，对其它疱疹类病毒及正常人基因组ＤＮＡ无交叉反应，一次性ＰＣＲ检测ＨＣＭＶ－ＡＤ１６９株基因组的最小检出量为１００ｆｇ，而套式ＰＣＲ可达１０ｆｇ，经ＰｓｔＩ酶切后，得到的片段与设计相符，对５８名孕早期孕妇外周静脉血     

PCR扩增IgH和TCR_β基因重排在检测淋巴细胞白血病微小残留病中的应用

利用ＩｇＨ和ＴＣＲ＿β克隆性基因重排原理，用多聚酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ．ＰＣＲ）技术检测小儿急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）骨髓和外周血共１３例。结果：ＡＬＬ初治的２例患儿ＰＣＲ检测全部呈现阳性特异性单带。ＡＬＬ完全缓解（ＣＲ）的１１例患儿中阳性７例，阴性４例，其中２例骨髓移植（ＢＭＴ）患儿移植前ＰＣＲ阳性，移植后转为阴性。１例自体骨髓移植（ａｕｔｏ－ＢＭＴ）患儿于移植后２个月时ＰＣＲ检测又重新出现阳性，但临床无复发现象。４例对照者ＰＣＲ均为阴性。结果表明ＰＣＲ技术具有简便、快速、敏感、特异性强等优点，在检测微小残留（ＭＲＤ）中具有广阔前景。     

聚合酶链反应法快速检测幽门螺杆菌

设计一互补于幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，ＨＰ）脲酶Ｃ基因片段的引物，建立快速检测ＨＰ的ＰＣＲ方法。ＨＰ标准菌株和临床分离株基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳显示３０１ｂｐ的特异区带，而其它几种常见的肠道菌均呈阴性。ＰＣＲ可检出少至１００个幽门螺杆菌细胞，并能用于临床胃粘膜活检标本中ＨＰ的检测，是一种快速、灵敏和特异的检测１ＩＰ的方法。     

体检发现谷丙转氨酶升高人群中检出TT病毒

目的：了解新型肝炎病毒—ＴＴ病毒在中国的流行情况，探讨其核酸变异性。方法：收集１９例健康体检发现谷丙转氨酶升高者的血清标本，采用ＰＣＲ方法检测ＴＴ病毒的ＤＮＡ。所得ＰＣＲ产物再采用限制性片段长度多态性分析和ＤＮＡ序列分析方法进行验证。最后将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的一些分离株进行比较，分析它们的同源性。结果：１９例转氨酶升高者中，２例ＰＣＲ检测呈阳性反应，其产物经限制性片段长度多态性分析证实为特异性产物。ＤＮＡ序列分析显示，２个阳性产物间的核酸同源性为９８７％，与Ｔａｋａｈａｓｈｉ等分离株和Ｏｋａｍｏｔｏ等分离株相比，同源性分别为９８７％和８９２％。两个ＴＴＶＤＮＡ片段中均存在精氨酸取代丝氨酸变异。结论：在中国广东人群中存在ＴＴ病毒感染，其核酸序列与Ｔａｋａｈａｓｈｉ等在日本得到的分离株高度同源。因而，设计ＰＣＲ引物时宜选择Ｔａｋａｈａｓｈｉ等分离株为标准。精氨酸取代丝氨酸变异的意义需进一步研究。     

耐药质粒在肠道杆菌间的接合传递研究

选用１３种抗菌药物对１８株肠道杆菌进行药敏试验、质烂检测并用传统及改良两种接合转移试验方法，以５株伤寒杆菌的不相容性Ｃ群（ｉｎｃＣ）Ｒ质粒、６株大肠杆菌及２株鼠伤寒杆菌的Ｒ质粒作供体，研究其在肠道杆菌间的传递。结果显示，Ｒ质粒能在４种肠道杆菌间互相传递，其中伤寒杆菌ｉｎｃＣ群Ｒ质粒能在这４种菌中稳定复江表达耐药性。质粒的可传递性给阻断耐药性的传播和疾病的防治带来很大困难，单纯消除某个菌中的耐药质粒     

检测端粒酶活性的PCR—ELISA方法的建立

建立一种更为敏感，特异的端粒酶检测方法。方法将分子生物学和免疫学方法有机地结合起来，建立ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法并检测多种肿瘤细胞株和部分组织中端粒酶活性。结论ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法检测端粒酶活性是一种简便，快速，无放射性污染的方法，适用于肿瘤早期诊断和普查。     

用聚合酶链反应快速检测血液中伤寒杆菌

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测伤寒患者血液标本中伤寒杆菌。根据伤寒杆菌鞭毛抗原基因ＤＮＡ的核苷酸序列，合成２对寡核苷酸引物，以该基因的ＤＮＡ片段作为模板，经首次ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ扩增后。产物分别为４５８ｂｐ和３４３ｂｐ的寡核苷酸片段。首次ＰＣＲ检测的敏感度可达１０条伤寒杆菌ＤＮＡ水平。对１０例有伤寒临床表现、血培养有伤寒杆菌生长的患者的血液标本进行了ＰＣＲ检测，结果，首次ＰＣＲ检测９例呈阳性；嵌套式ＰＣＲ检测１０例均呈阳性。对其中３例伤寒患者的血清和白细胞分别作ＰＣＲ检测，结果均呈阳性。这些结果提示大部分伤寒患者的血清标本只需作首次ＰＣＲ检测即可呈阳性。由于作者对标本的预处理方法作了改进，于９ｈ后可获首次ＰＣＲ结果     

聚合酶链反应技术快速诊断淋病

作者采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断女性淋病５０例，并将ＰＣＲ与淋菌分离培养比较，结果５０例宫颈分泌物ＰＣＲ检测获得阳性３５例，其中２０例与常规分离培养法一致，另外１５例ＰＣＲ阳性而分离培养为阴性，此１５例临床诊断为淋病，在检测中未见培养阳性而ＰＣＲ检测阴性者，用ＰＣＲ全部实验过程可在５ｈ内完成，较目前分离培养法鉴定淋球菌在时间上明显缩短，所以作者认为ＰＣＲ检测淋菌优于淋菌分离培养，具有简便快速、