降钙素基因逆转录巢式PCR及其临床应用价值的研究

目的：建立逆转录巢式（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ方法扩增降钙素（ＣＴ）基因,探讨急性白血病诱导分化前后ＣＴ基因甲基化模式以及在微小残留病灶（ＭＲＤ）诊断中的临床价值。方法提取骨髓单个核细胞（ＢＭＭＣ）中的总ＲＮＡ,用逆转录酶合成ｃＤＮＡ,再以巢式ＰＣＲ扩增含有Ｍ位点的ＣＴ基因片段,并以Ｈｐａ Ⅱ酶切ＰＣＲ扩增终产物,分析ＣＴ基因的甲基化模式。     

白血病细胞多巴胺受体基因甲基化研究

目的：探讨多巴胺受体（ＤＲＤ４）基因第一外显子中ＮｏｔＩ酶切位点甲基化与急性非洒巴细胞白血病（ＡＭＬ）的关系。方法：应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印记杂交与ＤＮＡ序列分析技术对ＡＭＬ患者骨髓标本进行分析。结果：在２７例白血病患者骨髓标本中１６例ＤＲＤ４基因甲基化（５９％），其中初治化疗敏感患者ＤＲＤ４基因甲基化发生率为５０％（９／１８），复发及难治患者甲基化发生率为７８％（７／９），而９例正常人骨髓标本ＤＲ     

细胞甩片、点片和涂片法原位杂交检测急性白血病多药耐药基因表达

目的：研究不同取材方法对检测白血病细胞多药耐药（ＭＤＲ１）基因表达的意义。方法：用细胞甩片、点片和涂片三种取材方法做原位杂交，检测了１０例急性白血病ＭＤＲ１基因表达水平。结果：发现１０例中７例表达ＭＤＲ１基因，ＭＤＲ１基因阳性率甩片法和点片法较高，涂片法较低；细胞形态学以甩片和涂片法较好，而点片法较差。结论：三种方法均可用于ＭＤＲ１基因检测，其中甩片法较可靠，涂片和点片法较简便     

应用PCR检测HL—60细胞诱导分化前后c—myc癌基因的扩增

应用ＰＣＲ方法研究了维甲酸（ＲＡ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ基因扩增的变化。结果：ＨＬ－６０细胞内ｃ－ｍｙｃ基因扩增为１１，经ＲＡ诱导６ｄ后，其扩增程度无明显变化，而ＤＭＳＯ诱导３ｄ后，ｃ－ｍｙｃ基因扩增出现下降，至５ｄ，较未诱导分化前下降约３０％。提示了ＲＡ和ＤＭＳＯ对ＨＬ－６０细胞不同的诱导分化机制。     

应用PCR检测HL－60细胞诱导分化前后c－myc癌基因的扩增

应用ＰＣＲ方法研究了维甲酸（ＲＡ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ基因扩增的变化。结果：ＨＬ－６０细胞内ｃ－ｍｙｃ基因扩增为１１，经ＲＡ诱导６ｄ后，其扩增程度无明显变化，而ＤＭＳＯ诱导３ｄ后，ｃ－ｍｙｃ基因扩增出现下降，至５ｄ，较未诱导分化前下降约３０％。提示了ＲＡ和ＤＭＳＯ对ＨＬ－６０细胞不同的诱导分化机制。     

应用流式细胞仪检测白血病 MDR1的表达

目的：探讨白血病 Ｍ Ｄ Ｒ１表达的意义,建立 Ｍ Ｄ Ｒ１检测的简便快速方法。方法：用流式细胞术和经 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ 标记 Ｍ Ｄ Ｒ１单克隆抗体检测白血病外周血有核细胞 Ｍ Ｄ Ｒ１的表达。结果：２４例急性白血病 Ｍ Ｄ Ｒ１表达为８９８±７４７,３例慢性白血病 Ｍ Ｄ Ｒ１表达为３６０±１３０,两组间差异有高度显著性（ Ｐ＜ ００１）。在急性非淋巴细胞白血病各亚型中, Ｍ ３的 Ｍ Ｄ Ｒ１表达最低,依次增高为 Ｍ ２、 Ｍ ４ ,３组间差异显著（ Ｐ＜ ００１）。结论：本方法简便、快速,可作为白血病临床治疗的评价指标。     

应用流式细胞仪检测白血病MDR1的表达

探讨白血病ＭＤＲ１表达的意义，建立ＭＤＲ１检测的简便快速方法。方法”用流式细胞术和经ＦＩＴＣ标记ＭＤＲ１单克隆抗体检测白血病外周血有核细胞ＭＤＲ１的表达。结果：２４例急性白血病ＭＤＲ１表达为８．９８±７．４３，３例慢性白血病ＭＤＲ１表达为３．６０±１．３０，两组间差异有高度显。     

二甲亚砜和维甲酸对人卵巢癌细胞COC-1的逆转作用研究

以人卵巢癌细胞株ＣＯＣ－１为模型，观察了诱导分化剂二甲亚砜（ＤＭＳＯ）与维甲酸（ＲＡ）对该细胞生长增殖、ＤＮＡ合成和超微结构的影响。结果显示：ＤＭＳＯ和ＲＡ可明显抑制ＣＯＣ－１细胞的生长和ＤＮＡ合成，并改变其恶性细胞的结构特征，使之向正常细胞的方向逆转，从而提示ＤＭＳＯ和ＲＡ对人卵巢癌细胞有一定的诱导分化作用。     

二甲亚砜和维甲酸对人卵巢癌细胞COC—1逆转作用研究

以人卵巢癌细胞株ＣＯＣ－１为模型，观察了诱导分化剂二甲亚砜（ＤＭＳＯ）与维甲酸（ＲＡ）对该细胞生长增殖，ＤＮＡ合成和超微结构的影响。结果显示：ＤＭＳＯ和ＲＡ可明显抑制ＣＯＣ－１细胞的生长和ＤＮＡ合成，并改变其恶性细胞的结构特征，使之向正常细胞的方向逆转，从而提示ＤＭＳＯ和ＲＡ对人卵巢癌细胞有一定的诱导分化作用。     

HL—60细胞降钙素基因高甲基化的发生机制

目的：探讨ＨＬ－６０细胞降钙素基因高甲基化的发生机制。方法：采用ＨＬ－６０细胞，以正常骨髓单个核细胞为对照，应用甲基化敏感的限制性内切酶消化，结合设有内外参照的ＰＣＲ技术，检测ＣＴ基因甲基化状态；应用同位素激量分析法检测ＤＮＡ－胞嘧啶－甲基转移酶（ＤＮＡ－ｃｙｔｏｓｉｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＴａｓｅ）活性；应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＭＴａｓｅ基因表达水平。结果：ＨＬ－６０细胞经甲基化敏感的内切酶Ｈｐａ Ⅱ消化后仍可扩增出清晰的ＣＴ基因特异条带，提示ＣＴ基因５’端呈高甲基化状态；ＨＬ－６０细胞ＭＴａｓｅ活性平均测定值为５３９．９Ｂｑ，是正常骨髓单个核细胞（平均２１．８Ｂｑ）的２９．８倍；ＭＴａｓｅ基因的ｍＲＮＡ表达水平以ＭＴａｓｅ与β－ａｃｔｉｎ内参照ＲＴ－ＰＣＲ产物的比值表示，ＨＬ－６０细胞（０     

恶性血液病降钙素基因高度甲基化的研究

目的 探讨降钙素（CT）基因高度甲基化在恶性血液病中的临床意义。方法 采用限制性内切酶（HPaⅡ）消化DNA和聚合酶链反应技术检测73例恶性血液病、6例正常人以及24例非恶性血液病的CT基因的基化程度。结果 12/14例（85.7%)急性淋巴细胞白血病、9/15例（60%）急性非淋巴细胞白血病、8/10例（80%）慢性粒细胞白血病、5/15（33.3%)淋巴瘤、2例（2/5）骨髓增生异常综合征、1例（1/2）恶性组织细胞病、1例（1/3）慢性淋巴细胞白轿病和1例（1/9）多发性骨髓瘤的病人出现CT基因高度甲基化阳性,而6例正常人和24例非恶性血液病无一例阳性。结论 CT基因高度甲基化可作为恶性血液病恶性克隆增殖的分子基因标志,从而为恶性血液病的诊断、微小残留病的监测及疾病的发展预测提供了一种有用手段。     

PCR检测降钙素基因高甲基化在监测慢性髓细胞白血病恶化中的价值

目的观察慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）病情恶化与降钙素（ＣＴ）基因高甲基化程度之间的关系。方法用内切酶酶切和ＰＣＲ技术研究４５例ＣＭＬ患者（其中慢性期３３例，加速期２例，急变期１０例）的ＣＴ基因高甲基化程度。ＣＴ基因未高甲基化，则能被相应内切酶切断，无法扩增出特异ＤＮＡ片断，否则，能扩增出特异ＤＮＡ片断，据此推断ＤＮＡ的甲基化程度。结果３例慢性期，２例加速期及８例急变期患者呈现降钙素基因高甲基化；急变期组（包括加速期）甲基化率明显高于慢性期组，两组有显著性差别（Ｐ＜０．０１）；１例在慢性期呈现ＣＴ基因高甲基化者于１０个月后发生急粒变。结论该方法有助于监测ＣＭＬ的恶化     

HpaⅡ—PCR检测慢性髓细胞白现降钙素基因甲基化

采用ＨｐａⅡ－ＰＣＲ检测３１例不同病期慢性髓细胞白血病降钙素基因甲基化。结果显示：降钙素基因的高甲基化与慢性髓细胞白血病恶性程度密切相关,加速期与夺始细胞危象期检出率远高于慢性期。提示检测降钙素基因甲基化水平期预测疾病转变和选择骨髓移植病例有参考价值。     

急性白血病钙素基因甲基化的PCR检测

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了１０例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）和２２例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）降钙素（ＣＴ）基因的甲基化程度。结果表明,７例ＡＬＬ与１６例ＡＭＬ的ＣＴ基因都发生了高度甲基化。临床完全缓解的３例ＡＭＬ和２例ＡＬＬ中有１例ＡＬＬ为阳性,另有１例阴性的ＡＭＬ于１个月后转为阳性,随后出现临床复发。提示急性白血病ＣＴ基因高度甲基化的ＰＣＲ检测,对ＡＬＬ与ＡＭＬ微小残留病有很重要的诊断价值,特别为缺乏恒定肿瘤细胞标志的ＡＭＬ提供了一个新的分子基因标志。     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.     

骨髓增生异常综合征P15INK4B基因甲基化及药物去甲基化作用

目的 检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者P15INK4B基因甲基化状况;探讨5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶(decitabine)和三氧化二砷(As2O3)对MDS患者细胞的去甲基化作用.方法 采用限制性内切酶联合PCR方法检测14例MDS患者P15INK4B基因甲基化,选择1例由MDS转化为急性白血病患者的外周血单个核细胞,分组分别加入decitabine和As2O3进行处理,分析甲基化程度变化情况.结论 低危组MDS患者(RCMD)均未发现P15INK4B基因甲基化,4例高危组MDS患者(RAEB)和4例 MDS-AL患者发现P15INK4B基因甲基化.经decitabine和As2O3处理后,MDS患者细胞的甲基化程度均降低50%左右.结论 MDS的发生与P15INK4B基因甲基化密切相关,decitabine和As2O3均对MDS患者细胞高度甲基化的P15INK4B基因具明显去甲基化作用.     

巢式甲基化特异性PCR检测p16基因的研究

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性.方法应用巢式甲基化特异性PCR技术(Nested-MSP)及甲基化特异性PCR(MSP),检测了结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因的异常甲基化情况;比较MSP及Nested-MSP两方法的灵敏度.结果应用MSP方法,Dukes A、B期病人和Dukes C、D期病人p16启动子区甲基化率分别为23.8%和59.4%;应用巢式-MSP方法,甲基化率上升至52.4%和84.4%.结论巢式-MSP的灵敏度明显高于普通的MSP技术,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助结直肠癌诊断的有效方法之一.     

恶性血液病降钙素基因高度甲基化的研究

目的　探讨降钙素 ( CT)基因高度甲基化在恶性血液病中的临床意义。方法　采用限制性内切酶 ( HPa )消化 DNA和聚合酶链反应技术检测 73例恶性血液病、6例正常人以及 2 4例非恶性血液病的 CT基因的甲基化程度。结果　 12 / 14例 ( 85 .7% )急性淋巴细胞白血病、9/ 15例 ( 6 0 % )急性非淋巴细胞白血病、8/ 10例( 80 % )慢性粒细胞白血病、5 / 15例 ( 33.3% )淋巴瘤、2例 ( 2 / 5 )骨髓增生异常综合征、1例 ( 1/ 2 )恶性组织细胞病、1例 ( 1/ 3)慢性淋巴细胞白血病和 1例 ( 1/ 9)多发性骨髓瘤的病人出现 CT基因高度甲基化阳性。而 6例正常人和 2 4例非恶性血液病无一例阳性。结论　 CT基因高度甲基化可作为恶性血液病恶性克隆增殖的分子基因标志 ,从而为恶性血液病的诊断、微小残留病的监测及疾病的发展预测提供了一种有用手段     

非小细胞肺癌患者血清死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化的分析

目的：分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清中死亡相关蛋白激酶（DAPK）基因启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义。方法：运用甲基化特异性PCR技术，检测65例NSCLC组患者血清DAPK基因启动子区域甲基化的改变情况，并分析与临床病理资料的关系。结果：NSCLC组患者血清DAPK基因甲基化检出率为30．8％（20／65），而对照组未检出，DAPK基因甲基化检出率与NSCLC病理类型、分期及转移状态无明显相关性。结论：DAPK基因启动子区域异常甲基化是NSCLC早期辅助诊断的分子标记物之一。     

PAX1基因启动子甲基化检测对宫颈癌及 宫颈癌前病变筛查的价值研究

目的 探讨配对盒基因家族PAX1基因启动子异常甲基化在宫颈癌和癌前病变早期诊断中的价值.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）、高分辨率溶解（HRM）技术,对人乳头瘤病毒（HPV）感染的正常宫颈脱落细胞、宫颈炎脱落细胞、CIN Ⅰ脱落细胞、CINⅡ～Ⅲ脱落细胞及宫颈癌脱落细胞中的PAX1基因启动子进行甲基化检测,比较两种方法对不同级别宫颈病变的敏感度和特异度.结果 两种方法宫颈癌脱落细胞组与正常＋宫颈炎脱落细胞组以及CINI,CINII～III宫颈脱落细胞组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）.MSP法和HRM法检测PAX1基因启动子甲基化筛查宫颈癌的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为54.55％,89.66％,66.67％,83.87％和72.73％,87.93％,69.57％,89.47％.结论 PAX1基因启动子甲基化对于宫颈癌临床诊断具有重要价值,HRM技术应用前景广阔.