获得性免疫缺陷综合征患者白假丝酵母分离株基因型及耐药性分析

目的研究获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者白假丝酵母分离株的基因型及耐药性。方法对分离自上海市公共卫生中心AIDS住院患者的40株白假丝酵母,应用微卫星核心序列引物M13进行聚合酶链反应（PCR）指纹分型。用微量稀释法分析白假丝酵母抗真菌药物敏感性。结果PCR指纹分型将所有白假丝酵母分离株分为A、B、C、D 4种基因型,其中A型14株（35.0%）,B型16株（40.0%）,C型9株（22.5%）,D型1株（2.5%）。白假丝酵母对抗真菌药物的耐药率为：两性霉素B 2.5%,氟康唑22.5%,伊曲康唑15.0%,氟胞嘧啶20.0%,;不同基因型白假丝酵母菌株间耐药性差异无统计学意义。结论上海市AIDS住院患者分离的白假丝酵母主要由3种克隆组成,但无明显优势流行株。     

获得性免疫缺陷综合征患者白假丝酵母分离株基因型及耐药性分析

目的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者白假丝酵母分离株的基因型及耐药性。方法对分离自上海市公共卫生中心AIDS住院患者的40株白假丝酵母,应用微卫星核心序列引物M13进行聚合酶链反应(PCR)指纹分型。用微量稀释法分析白假丝酵母抗真菌药物敏感性。结果PCR指纹分型将所有白假丝酵母分离株分为A、B、C、D 4种基因型,其中A型14株(35.0%),B型16株(40.0%),C型9株(22.5%),D型1株(2.5%)。白假丝酵母对抗真菌药物的耐药率为:两性霉素B 2.5%,氟康唑22.5%,伊曲康唑15.0%,氟胞嘧啶20.0%,;不同基因型白假丝酵母菌株间耐药性差异无统计学意义。结论上海市AIDS住院患者分离的白假丝酵母主要由3种克隆组成,但无明显优势流行株。     

临床分离白假丝酵母菌对氟康唑的耐药性分析

目的了解镇江地区临床分离的白假丝酵母菌对抗真菌药物氟康唑的体外敏感性。方法微量稀释法测定64株临床分离白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性,结果用氟康唑的最低抑菌浓度（MIC）表示。结果氟康唑对64株临床分离白假丝酵母菌的MIC为0．125-0．5μg／mL。结论氟康唑对白假丝酵母菌有较好的体外抗真菌活性。     

酵母样真菌56株的分离鉴定及药物敏感性分析

目的对1100例标本中分离出的56株酵母样真菌进行菌种鉴定及常用抗真菌药物的敏感性分析,以指导临床合理用药。方法用常规培养方法从临床标本中分离出的56株酵母样真菌用柯玛嘉显色培养基纯培养,根据菌落颜色进行分类,可疑者在法国biomerieux的VITEK-32全自动细菌分析仪上鉴定,用ATB FUNGUS 2INT试条做药敏分析。结果56株酵母样真菌中,白色假丝酵母菌检出率最高（75．0％）,其次为热带假丝酵母菌（14．3％）,光滑假丝酵母菌（7．1％）,检出葡萄牙假丝酵母菌、郎比可假丝酵母菌各1株。酵母样真菌对5-氟胞嘧啶（5-FC）、两性菌素B（AMB）、氟康唑（FCA）、依曲康唑（ITR）、伏立康唑（VRC）的敏感性分别为100％、100％、23．2％、17．9％和28．6％。结论临床酵母样真菌感染以白色假丝酵母菌为主,对5-氟胞嘧啶、两性菌素B敏感性较高,对氟康唑、依曲康唑、伏立康唑有不同程度的耐药,因此,临床上必须重视真菌的检出和药敏试验。临床医生应根据药敏结果合理使用抗真菌药物。     

光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌环境分离株的氟康唑敏感性与多位点序列分型分析

目的 分析分离自树叶、树皮和腐殖质的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌,对其进行耐药性分析和分子流行病学分型,比较环境分离株与临床分离株的进化关系,为流行病学调查及有效控制侵袭性假丝酵母菌感染提供理论支持。 方法 2017年9月采集云南省境内环境标本,分离培养提取菌株DNA进行转录间隔区测序鉴定;使用微量肉汤稀释法进行氟康唑药敏实验;采用多位点序列分型进行分子流行病学分型;利用eBURST分析菌株亲缘性。 结果 采集环境标本200份,分离光滑假丝酵母菌3株和热带假丝酵母菌10株。 13株环境分离株均对氟康唑敏感。 3株光滑假丝酵母菌的序列型均为ST3,10株热带假丝酵母菌被分为7个二倍体序列（DST）,包括4个新DST型（DST813 ~ DST816）。 eBURST分析显示,光滑假丝酵母菌均为CC3型,CC730是热带假丝酵母菌环境株的主要型别。 结论 环境分离株与临床分离株存在相同的起源株。 树叶、树皮或腐殖质中的光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌可能对人类健康造成危害,是人类假丝酵母菌感染的潜在来源。      

白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11基因分析

目的 研究白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11的变异情况.方法 将93例诊断为真菌性阴道炎的患者的阴道分泌物标本进行真菌培养,筛选白假丝酵母菌菌株,利用纸片扩散法进行氟康唑、酮康唑、咪康唑药敏试验,用加热裂解法提取菌株DNA,扩增ERG11基因,扩增后的PCR产物进行双向测序,测序结果与GenBank中的标准序列（SC5314）比较分析.结果 93例均培养出假丝酵母菌,包括60株白假丝酵母菌,19株热带假丝酵母菌,9株克柔假丝酵母菌和5株光滑假丝酵母菌;白假丝酵母菌对氟康唑、酮康唑、咪康唑耐药率分别为13.33%,20.00％和51.67％;对白假丝酵母菌的ERG11基因测序发现存在25个碱基突变位点,其中13个同义突变,12个错义突变,其中有6个是新变异：V36F,V51L,T123I,E194K,Y257H和K344N.结论 耐吡咯类药物白假丝酵母菌ERG11基因有多个错义突变位点,其中某些位点突变导致的氨基酸变异可能与其耐药性产生有关.     

白假丝酵母菌随机扩增多态DNA分型及其流行趋势分析

目的:探讨采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析临床分离的白假丝酵母菌分型结果及其流行趋势。方法:选用不同的引物、Mg~(2+)、模板浓度、Taq聚合酶用量等,获得一优化的反应体系以对白假丝酵母菌进行RAPD分型。结果:经优化的RAPD方法能将105株白假丝酵母菌菌株分成8个基因型。结论:结果显示该方法的可分型性、灵敏度、重复性及特异度均较良好,可对白假丝酵母菌快速、简便地进行基因分型,可广泛应用于流行病学调查与研究。     

412株假丝酵母菌的菌种鉴定及其耐药性分析

目的 分析临床假丝酵母菌属感染的种类及其对5种抗真菌药物的耐药性.方法 选择该院门诊及住院患者412例,采集其痰液、咽拭子、中段尿、大便或分泌物等,共检出假丝酵母菌属412株.使用沙保弱培养基培养并分离菌种,柯玛嘉显色培养基进行初步筛选,必要时进行假丝酵母菌属同化及糖（醇）的发酵试验进行菌种鉴定.采用法国生物梅里埃公司提供的ATB-FUNGUS3酵母样真菌药敏试剂盒,采用微量稀释法进行检测.标准菌株为白色假丝酵母菌ATCC90028、近平滑假丝酵母菌ATCC22019.结果 分离的412株假丝酵母菌属中,以白色假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌为主;感染部位以下呼吸道（痰液）居多.在该院所用的5种抗真菌药物中,两性霉素B敏感性最高;热带假丝酵母菌对药物的耐药性明显高于白色假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌.结论 检验人员应与临床医务人员沟通,鉴别定居菌与致病菌及其临床价值,指导临床合理用药.     

126株获得性感染假丝酵母菌分布特点及耐药分析

目的研究医院内获得性假丝酵母菌感染特点,观察临床分离的假丝酵母菌分布及其耐药性。方法通过对临床标本分离培养和菌种鉴定方法,对医院内获得真菌感染患者的标本进行了检测。结果共分离出126株假丝酵母菌均来自病人血液标本,其中白色假丝酵母菌74株(58.70%),其余分别为光滑假丝酵母菌24株、热带假丝酵母菌13株、近平滑假丝酵母菌12株和其它假丝酵母菌6株。临床分离的假丝酵母菌除对氟康唑耐药率达到58.90%之外,对其他抗真菌药物耐药率较低。结论医院内获得性假丝酵母菌感染主要是白假丝酵母菌,均分离自血液标本,提示需要监测真菌耐药性发展趋势。     

Agilent2100分析仪在鲍曼不动杆菌同源性分析中的应用

目的Agilent2100分析仪在基因组外非编码重复序列片段的聚合酶链反应（REP-PCR）同源性分析中的应用并评估该系统。方法应用REP设计引物并进行PCR扩增,用Agilent2100分析仪DL7500 Labchip芯片进行产物分析。结果51株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌中,耐药菌株分为4大型别（A、B、C、D）,其中A型共48株,分别为A1型33株,A2型13株,A3型和A4型各1株;B、C、D型各1株;18株碳青霉烯类敏感菌株中,有2株与A1型别一致,其他菌株型别都不一致。结论基于REP-PCR的Agilent2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率、结果定量处理和多种形式输出等优点,可作为临床同源性分析鉴定和分型的一线工具。     

Agilent2100分析仪在鲍曼不动杆菌同源性分析中的应用

目的Agilent 2100分析仪在基因组外非编码重复序列片段的聚合酶链反应(REP-PCR)同源性分析中的应用并评估该系统。方法应用REP设计引物并进行PCR扩增,用Agilent2100分析仪DL7500 Labch ip芯片进行产物分析。结果51株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌中,耐药菌株分为4大型别(A、B、C、D),其中A型共48株,分别为A1型33株,A2型13株,A3型和A4型各1株;B、C、D型各1株;18株碳青霉烯类敏感菌株中,有2株与A1型别一致,其他菌株型别都不一致。结论基于REP-PCR的Agilent2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率、结果定量处理和多种形式输出等优点,可作为临床同源性分析鉴定和分型的一线工具。     

Detection of DNA mutations associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer

BACKGROUND: Molecular analysis of mitochondrial DNA (mtDNA) has provided a final diagnosis for many of the mitochondrial diseases. We evaluated the Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) to determine whether the system could replace the conventional restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis by the agarose gel electrophoresis for the detection of the mtDNA mutation. METHODS: Three members of a family with MELAS syndrome and four members of a family with MERRF syndrome were recruited for this study. After PCR and restriction enzyme digestion, DNA fragments were separated on the Agilent 2100 bioanalyzer in conjunction with the DNA 500 and DNA 1000 Labchip kits and by electrophoresis on precast 3% agarose gels. RESULTS: The data generated by the DNA 500 and DNA 1000 assays using the Agilent 2100 bioanalyzer showed a lower percentage error and a better reproducibility as compared to those obtained by the conventional method. CONCLUSION: Based on the performance of the bioanalyzer, we suggest that this novel Labchip is adequate to replace the current RFLP analysis by the agarose gel electrophoresis for mtDNA mutation detection.     

真菌基因组DNA的提取和通用PCR检测方法的建立

目的改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应（PCR）,为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。方法参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方法,作改良以确立本研究中所采纳的手段,并应用真菌核糖体DNA（rDNA）通用引物,以实验室保存的标准菌株及临床分离菌株来建立临床真菌感染检测用通用PCR。结果白念珠菌和烟曲霉在75℃温度下分别作用60和80min可以完全被灭活。经目前多种破壁方法的探讨,发现对于白念珠菌（单细胞真菌）选用酶消化法,破壁效率高达98．29％,而烟曲霉（多细胞真菌）则需要酶消化法与打击器振荡法联合应用,其破壁率也可达66．68％,进一步用酚氯仿法抽提其基因组DNA,能够获得相对纯度高且有一定得量。当选择真菌rDNAITS2区间的一对通用引物,通过PCR反应体系的优化,使得本研究中建立的通用PCR,对于白念珠菌和烟曲霉的检测下限分别为5个和9．7个,其PCR产物测序结果与数据库比对完全一致,同时选择临床分离的或实验室保存的其他真菌、细菌和病毒株进行验证,该方法仅针对真菌群,结合测序分析可以实现种属水平的鉴定。结论改良真菌基因组DNA提取后所建立的针对真菌rDNA的通用PCR敏感且特异,适宜实验室操作。     

Use of different PCR-based DNA fingerprinting techniques and pulsed-field gel electrophoresis to investigate the epidemiology of Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex

Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex is an important nosocomial pathogen for which optimal typing methods in epidemiologic investigations have not been defined. We compared DNA macrorestriction analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with different PCR-based DNA fingerprinting techniques, including enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) polymerase chain reaction (PCR), repetitive extragenic palindromic (REP) PCR, arbitrary-primed PCR with primer M13, and multiplex PCR with primers REP-1, REP-2 and M13, for characterization of 98 clinical isolates (including 10 apparent outbreak-related isolates and 68 presumed epidemiologically unrelated isolates) in a tertiary-care hospital over a 4-year period. The PFGE patterns after SmaI restriction of the bacterial DNA were analyzed by computer software (Gelcompar) using the unweighted pair group method with arithmetic averages clustering and the Dice coefficient. A cluster of 48 isolates (cluster A), including 9 outbreak isolates, linked at a level of 83.4% similarity was observed. This epidemic strain and its variants were also found among the 68 presumed epidemiologically unrelated isolates, and this may represent ongoing endemic infection in this institution. The discrimination index for the PCR-based DNA fingerprinting techniques was 0.75 for enterobacterial repetitive intergenic consensus 1, 0.71 for M13, 0.77 for REP-1, 0.77 for REP-2, and 0.87 for multiplex PCR. The discriminatory power of PFGE was found to be higher than those of PCR-based techniques. It was concluded that both PFGE and PCR-based fingerprinting are useful for typing of A. calcoaceticus-A. baumannii complex. However, PFGE can detect minor mutations among outbreak strains, and this is important for epidemiological study of this species in a complex endemic setting.     

中国部分地区159株结核分枝杆菌临床分离株MLVA-19分型分析

目的初步了解中国部分地区结核分枝杆菌临床分离菌株数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeats,VNTRs)基因多态性特征。 方法采用多位点VNTRs分析（multiple loci VNTRS analysis, MLVA）技术,随机选取159株中国部分地区结核分枝杆菌临床分离菌株,PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对结核分枝杆菌的19个VNTRs位点进行检测,用BioNumerics (Version 5.0) 软件进行结果分析,数据结果与国际MLVA数据库（http://minisatellites.u-psud.fr）比对,初步分析结核分枝杆菌DNA 多态性特征。结果159株菌株大致被分成4个主要的簇,其中73.8%的菌株为北京家族菌株,其次为H37Rv相似菌株及在数据库中没有比对结果的一簇,这一簇的MLVA特点是ETRD3,MIRU10、MIRU27、MIRU39、MIRU40及Mtub21位点结果为22221,与其他簇的菌株结果有比较明显的区别。可能是中国特有的菌株。另外发现与BCG相似的一簇。结论本次研究中的中国结核分枝杆菌具有明显的VNTR基因多态性,主要流行菌株为北京家族菌株,可能存在中国特异的VNTR基因型。BCG临床分离株的发现,提示BCG疫苗相关病例可能成为值得关注的卫生问题。     

建立白色念珠菌蛋白指纹库的研究

目的探讨白色念珠菌蛋白指纹库的建立,为白色念珠菌感染快速诊断奠定基础。方法收集96株临床分离的白色念珠菌,提取DNA,采用聚合酶链反应（PCR）扩增其ITS1-5.8S-ITS2基因片段,利用限制性内切酶对其进行鉴定。应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）仪检测念珠菌蛋白指纹,Ciphergen ProteinChip软件自动采集数据,筛选稳定表达蛋白峰建立白色念珠菌蛋白指纹库,运用经准确鉴定的念珠菌对建立的蛋白指纹库进行验证。结果限制性片段长度多态性分析证实临床分离的所有菌株均为白色念珠菌。SELDI-TOF-MS芯片能捕获15个蛋白峰,其中5个蛋白峰在所有白色念珠菌中均稳定表达,利用相似性分析软件建立白色念珠菌蛋白指纹库,白色念珠菌蛋白指纹与建立数据库的相似性大于95%,而其他种类念珠菌蛋白指纹与数据库的相似性均小于50%。结论白色念珠菌蛋白指纹库的建立为快速诊断白色念珠菌感染提供了理论依据。     

细菌rDNA分类鉴定的方法学研究

目的 研究细菌rDNA快速鉴定方法.方法 以细菌16S rDNA、16S-23S rDNA基因间隔区（ISR）和常见细菌耐药基因为对象,通过改进标本中细菌DNA提取方法,指纹分析、直接测序与多重聚合酶链反应（PCR）技术,建立快速细菌分子鉴定方法.结果 细菌属种不同表现出独特的16S-23S rDNA ISR指纹,在分析软件指导下进行初步细菌鉴定和亲缘关系研究;16S rDNA和16S-23SrDNA ISR序列可确定细菌种与型;序列分析与生化鉴定一致.多重PCR可解决葡萄球菌16S rDNA与mecA基因、产超广谱β内酰胺酶菌16S rDNA与TEM和SHV基因同步检测.结论 细菌rDNA分类方法,提高了非培养细菌的鉴定能力.