人RNF6基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的表达

目的 构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 提取前列腺癌细胞CWR22Rvl的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX5X-1,在E.coli BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 hRNF6编...     

利用RNA干涉技术研究雄激素受体在人前列腺癌细胞增殖中的作用

目的: 利用RNA干涉技术抑制雄激素受体(AR)的表达,研究AR在激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞增殖中的作用。方法: 设计、合成针对AR的4种不同的小干涉RNA(siRNA),连接到带有人H1启动子的腺病毒载体质粒pShuttle-H1-Ri中,构建成能产生AR-siRNA的质粒pShuttle-H1-Ri-AR,与能表达AR的质粒pcDNA-AR共转染HEK293细胞,Western blot 检测不同的siRNA对AR表达的抑制效率,选取抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒,感染LNCap、C4-2B和CWR22Rv1 3种对雄激素有不同反应性的人前列腺癌细胞,采用Western blot 检测感染后细胞中AR的表达程度,并用MTT比色法测定细胞的增殖活性。结果: 4种siRNA都能抑制共转染AR的表达,用抑制效率高的siRNA制备重组腺病毒感染3种靶细胞后,均能特异性地抑制3种细胞中AR的表达,细胞的增殖活性也随之明显下降。结论: AR-siRNA通过抑制激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞中AR的表达,有效地抑制细胞的增殖,AR对维持激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖活性具有十分重要的作用,是治疗前列腺癌的重要靶分子。     

AR-V7在前列腺癌细胞耐药中的作用

目的:探讨雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)在前列腺癌细胞耐药中的作用及分子机制。方法:运用Lipofectamine2000转染法将AR-V7 siRNA(siAR-V7)转染至4株前列腺癌细胞中,命名为PC3-siAR-V7、DU145-siAR-V7、LNCaP-siAR-V7和ArCaP-siAR-V7细胞,以转染无关序列(NC siRNA)为阴性对照。运用real-timePCR和Westernblot实验分别检测转染前后细胞中AR-V7的mRNA和蛋白表达水平;运用MTT法和Transwell法分别检测细胞活力和细胞迁移率;运用萤光素酶报告基因实验和Western blot实验分别检测AR的启动子活性及下游靶基因前列腺特异性抗原(PSA)和FK506结合蛋白5(FKBP5)的蛋白表达。构建耐比卡鲁胺的前列腺癌细胞系LNCaP-DR,运用免疫荧光观察LNCaP、LNCaP-siAR-V7和LNCaP-DR细胞中AR和AR-V7的亚细胞定位;运用蛋白质免疫共沉淀实验检测AR-V7与热休克蛋白90(HSP90)的相互作用。结果:4株前列腺癌细胞中的AR-V7 mRNA水平显著高于正常前列腺上皮细胞RWPE-1(P0.05);PC3-siAR-V7、DU145-siAR-V7、LNCaP-siAR-V7和ArCaPsiAR-V7细胞中AR-V7蛋白水平、细胞活性及细胞迁移率显著低于NCsiRNA转染的细胞(P0.05)。随着比卡鲁胺剂量的增加,所有细胞活力逐渐降低,而下调AR-V7表达显著增强前列腺癌细胞对比卡鲁胺的敏感性(P0.05)。Westernblot结果显示下调AR-V7表达显著抑制AR启动子活性,其下游PSA和FKBP5蛋白水平明显降低(P0.05)。免疫荧光结果发现AR和AR-V7主要存在于前列腺癌细胞核内,AR少量存在于细胞质中;下调AR-V7表达则抑制AR的核转运;AR存在于耐药细胞核中,AR-V7在耐药细胞中高表达。免疫共沉淀结果显示内源性AR-V7与HSP90相互作用。结论:AR-V7在前列腺癌细胞中高表达,下调AR-V7的表达显著抑制前列腺癌细胞活力和迁移;前列腺癌细胞耐药与AR-V7高表达相关,其机制可能通过AR-V7与HSP90相互作用介导AR-V7的核转运,激活AR信号通路调控下游靶基因的转录活性最终导致细胞耐药。     

体外激酶实验筛选p21活化激酶6对雄激素受体的磷酸化位点

目的构建雄激素受体(AR)的点突变原核表达质粒,以体外激酶实验分析筛选p21活化激酶6(PAK6)对雄激素受体的磷酸化位点,更好的研究PAK6对AR的磷酸化所发挥的生物学功能。方法利用体外激酶实验分析PAK6对AR的较小磷酸化区域,并利用重叠延伸PCR的方法构建可能的磷酸化定点突变体;然后,体外纯化带有GST标签的突变体蛋白,及体外激酶实验筛选PAK6对AR的磷酸化位点。结果证明质粒构建成功,构建雄激素受体定点突变体,确定PAK6磷酸化雄激素受体位点。结论成功筛选PAK6对AR的磷酸化位点是578位丝氨酸。     

HO-1高表达对脂肪干细胞在低氧无血清条件下的保护作用及机制

 目的:探讨诱导内源性血红素氧合酶-1（HO-1）表达对脂肪干细胞（ADSCs）在低氧无血清条件下的保护作用及其可能的分子机制。方法: 分离培养SD大鼠脂肪干细胞进行低氧无血清处理,DAPI染色检测细胞凋亡率;Western blotting 法分析HO-1、NLRP3 、凋亡相关斑点样蛋白 (ASC)和cleaved caspase-1的蛋白表达;ELISA 法测定培养上清液中白细胞介素-1β (IL-1β) 的水平;采用 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧 (ROS) 的水平。结果: 钴原卟啉诱导ADSCs HO-1蛋白呈剂量依赖性表达,以20 μmol/L最为显著;诱导内源性HO-1的表达明显抑制ADSCs在低氧无血清条件下的细胞凋亡率和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1的蛋白表达,并减少细胞内ROS和上清液IL-1β的水平;而这种保护效应可被同时给予的HO-1抑制剂锌原卟啉所逆转。结论: 诱导内源性HO-1的表达可能通过抑制NLRP3炎症小体的激活以及减少IL-1β的分泌,对低氧无血清条件下ADSCs发挥保护作用。     

EpCAM和HDAC6在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞迁移的影响

目的 探讨上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase, HDAC6)蛋白在前列腺癌及癌旁良性组织中的表达及与前列腺癌临床病理特征的关系,并分析两蛋白之间的相关性。探讨沉默EpCAM对前列腺癌细胞迁移及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响。方法 利用TIMER和UALCAN数据库分析EpCAM和HDAC6 mRNA在各种癌症中的表达情况及在前列腺癌和正常前列腺组织中的表达差异。采用免疫组化法观察EpCAM和HDAC6蛋白在前列腺癌和癌旁良性组织中的表达情况,分析两者间的相关性及与前列腺癌临床病理特征的关系。通过体外实验检测沉默EpCAM蛋白对前列腺癌细胞迁移能力的影响。Western blot实验检测前列腺癌细胞中EMT相关蛋白的表达。结果 数据库分析结果显示,EpCAM和HDAC6 mRNA在前列腺癌中均呈高表达,且与前列腺癌Gleason评分和淋巴结转移相关。前列腺癌组织中EpCAM蛋白高表达率高于癌旁良...     

白细胞介素13抑制肾小球系膜细胞增殖及白细胞介素6表达

目的:探讨白细胞介素13(IL-13)对体外培养的大鼠系膜细胞的增殖及其产生白细胞介素6(IL-6)的影响。方法:用四甲基偶氮唑(MTT)法测定系膜细胞增殖,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附法(ELISA)测定系膜细胞IL-6mRNA表达及其蛋白水平。结果:IL-13在1、10、100μg/L浓度范围呈剂量依赖性地抑制系膜细胞的增殖;5%FCSRPMI1640培养条件下系膜细胞IL-6mRNA表达及IL-6分泌水平较低,脂多糖(LPS)可刺激系膜细胞IL-6mRNA的表达及提高IL-6分泌水平,而IL-13可抑制LPS诱导的系膜细胞IL-6分泌及其mRNA表达。结论:IL-13抑制体外培养的系膜细胞增殖及LPS诱导的系膜细胞IL-6的产生,IL-13可能对于肾小球肾炎的系膜细胞炎症反应具有拮抗作用。     

不同体外条件培养对大鼠血管平滑肌细胞表型、增殖和细胞骨架的影响

目的 探讨不同体外培养条件与血管平滑肌细胞(VSMCs)表型、增殖和细胞骨架蛋白表达之间的差异及生物学意义。 方法 体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,实验分为6组：2代对照组、2代血清饥饿组、4代对照组、4代血清饥饿组、6代对照组和6代血清饥饿组;用5-Brdu标记增殖细胞;RT-PCR检测表型基因SM22ɑ mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白SMɑ-actin、β-Tubulin和Desmin的表达。 结果 体外培养的VSMCs,随培养代数的增多,细胞骨架蛋白表达减少,电镜超微结构可见胞质中内质网、高尔基体等细胞器增多,有大量的分泌小泡;血清饥饿胞中线粒体增多并电子密度增高。 血清培养条件下SMɑ-actin随培养代数的增加其表达减少,血清饥饿培养可使SMɑ-actin表达可逆性上调;β-Tubulin和Desmin随培养代数的增加表达减少更明显,而血清饥饿上调作用也不明显,至第6代基本不表达。 结论 血清培养和血清饥饿培养在不同代中对VSMCs表型转化、增殖和细胞骨架有着不同的影响,它们之间存在着内在的联系,在维持细胞形态、收缩功能和血管重构方面起了重要作用。β-Tubulin和Desmin表达消失可能具有重要生物学意义。     

液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在人前列腺癌细胞系中的表达及其意义

目的探讨液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在不同转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达及其意义。方法采用半定量RT-PCR、荧光实时定量RT-PCR和Western blot法检测ATP6V0C在人不同转移潜能前列腺癌细胞系PC-3M-1E8、PC-3M(高转移潜能)和PC-3M-2B4、PC-3(低转移潜能)中的表达。结果 ATP6V0C在PC-3M-1E8、PC-3M细胞系中的mRNA及蛋白表达量均明显高于在PC-3M-2B4、PC-3细胞系中的表达,其中,ATP6V0C在PC-3M-1E8中的表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系,证明其和肿瘤的转移密切相关,有可能成为判断人前列腺癌侵袭和转移的重要指标及治疗前列腺癌的新靶点。     

沉默URG11基因对前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移与侵袭的影响

 目的: 观察上调基因11(up-regulated gene 11,URG11)在前列腺癌细胞系中的表达及降低URG11表达对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和侵袭能力的影响。方法: 用real-time PCR和Western blot检测前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白水平;设计针对URG11基因的siRNA靶序列,转染LNCaP细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,MTS测定LNCaP细胞增殖能力,划痕和侵袭实验评价LNCaP细胞迁移及侵袭能力。结果: 在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌细胞系和RWPE-1正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白表达水平存在显著差异,在前列腺癌细胞中URG11 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,转染URG11 siRNA的LNCaP细胞增殖停滞在G₁/S期并诱导前列腺癌细胞凋亡,转染组的细胞凋亡率为8.79%±0.12%,而且LNCaP肿瘤细胞的迁移及侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论: URG11在前列腺癌系中高表达。通过RNAi沉默URG11基因能明显抑制LNCaP细胞增殖和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。     

p21活化激酶6削弱非小细胞肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的分子机制

 目的：探讨调控p21活化激酶6(PAK6)的微小RNA（miRNA）与非小细胞肺癌侵袭及迁移的关系,并了解PAK6下游分子信号机制。方法：通过生物信息学数据库预测靶向PAK6的miRNA,转染miRNA模拟物及抑制剂,Western blotting及实时定量荧光PCR（real-time PCR）检测A549细胞中PAK6的表达量,萤光素报告酶实验检测预测miRNA对PAK6的调控,并行体外迁移及侵袭实验,检测转染miRNA对PC-3细胞迁移及侵袭能力的影响。转染目标miRNA及siPAK6,Western blotting检测A549细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达量。结果：生物信息学预测miR-23a可能是调控PAK6的靶向miRNA。Western blotting检测转染miR-23a组PAK6表达量下降69％,而转染miR-23a抑制剂组PAK6表达量上升52％,差异均有统计学意义。萤光素报告酶实验结果显示,转染miR-23a后野生型PAK6组萤光素酶活性下降52％,而突变组差异无统计学意义（P＞0.05）。Real-time PCR检测3组PAK6 mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。体外迁移及侵袭实验示,转染miR-23a组迁移细胞数减少73％,侵袭的细胞数减少59％。Western blotting检测发现,转染siPAK6组MMP-9的表达下降85％（P＜0.01）,转染miR-23a组MMP-9的表达下降76％（P＜0.01）。结论：miR-23a通过PAK6-MMP-9信号途径引起非小细胞肺癌细胞迁移及侵袭能力的下降。     

p21活化激酶6对人非小细胞肺癌A549细胞侵袭及迁移能力的影响

 目的：探讨p21活化激酶6（PAK6）对非小细胞肺癌侵袭及迁移能力的影响及机制研究。方法：实时荧光定量PCR检测人非小细胞肺癌A548细胞、人支气管上皮细胞、非小细胞肺癌组织及癌旁组织中PAK6 mRNA的表达。A549细胞分别转染siRNA-PAK6（siPAK6组）和阴性对照（对照组）,实时荧光定量PCR技术检测PAK6 mRNA,Western blotting检测PAK6表达量;并行体外迁移及侵袭实验,检测转染siRNA-PAK6对A549细胞侵袭及迁移能力的影响;共聚焦显微镜观察细胞骨架的改变。结果：A549细胞中PAK6 mRNA的表达量明显高于人支气管上皮细胞中PAK6 mRNA的表达量（3.50±1.16 vs 1.12±0.42,P<0.05）,非小细胞肺癌组织中PAK6 mRNA的表达量明显高于癌旁组织中PAK6 mRNA的表达量（5.13±1.33  vs 1.08±0.37,P<0.05）。A549细胞转染siPAK6后,PAK6蛋白表达量下降72%（P<0.05）,PAK6 mRNA水平明显下降（3.72±0.75 vs  0.69±0.21,P<0.05）。A549细胞转染siPAK6组侵袭及迁移出的细胞数量明显少于对照组(P<0.05)。siPAK6组A549细胞骨架应力纤维减少明显,肌动蛋白皱缩。结论：PAK6通过细胞骨架的重构影响非小细胞肺癌的侵袭及迁移能力。     

IL-6/JAK/STAT3信号通路在前列腺癌发展和治疗中的研究进展

IL-6/JAK/STAT3是IL-6激活的显著的信号通路之一。IL-6、p-STAT3在前列腺癌(PCa)组织和转移瘤中高表达,在诱导PCa发生、促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移中起着关键作用,并且通过激活雄激素受体(AR)参与PCa去势抵抗和肿瘤耐药。IL-6/JAK/STAT3及其激活的下游因子在肿瘤进展中的多种角色为化疗药物开发提供了良好的基础,目前,许多靶向抑制剂已被证明可有效抑制肿瘤进展,有望研发出更多有效药物。     

Osteoblasts induce prostate cancer proliferation and PSA expression through interleukin-6-mediated activation of the androgen receptor

Prostate cancer (CaP) metastases selectively develop in bone as opposed to other sites through unknown mechanisms. Interleukin-6 (IL-6) is considered to contribute to CaP progression and is produced at high levels in osteoblasts. We hypothesized that osteoblast-derived IL-6 in the bone microenvironment contributes to the fertile soil for CaP growth. Accordingly, human CaP cells, LNCaP, C4-2B and VCaP, were treated with conditioned medium (CM) collected from human osteoblast-like HOBIT cells grown in androgen-depleted medium. We found that CM induced proliferation, prostate-specific antigen (PSA) protein and mRNA expression in a dose-dependent manner in these cell lines as determined by ELISA and real-time PCR, respectively. CM also activated the PSA promoter in these cells. Both HOBIT and primary osteoblast (POB) cells produced high levels of IL-6 measured by bioassay. LNCaP, C4-2B and VCaP cells expressed IL-6, but at much lower levels then the HOBIT and POB and they also expressed the IL-6 receptor mRNA, indicating they can respond to IL-6. Anti-IL-6 antibody added to HOBIT or POB CM dose-dependently inhibited the CM-induced cell proliferation and PSA expression in these CaP cell lines. HOBIT CM induced nuclear translocation of the AR and this was inhibited by anti-IL-6 antibody. Additionally, the antiandrogen bicalutamide inhibited HOBIT CM-induced cell proliferation. These results demonstrate that osteoblasts promote CaP growth through IL-6-mediated activation of the AR. Furthermore, these data underscore the importance of cross-talk between tumor and the bone microenvironment in the development of CaP bone metastases.     

The p38 transduction pathway in prostatic neoplasia

It has been proposed that, among other cellular responses, TNF-alpha induces not only cell death, but also cell proliferation by activation of p38. It has also been reported that IL-1-alpha favours cell proliferation by p38 activation. The aim of the present study was to evaluate upstream (alpha-PAK, MEK-6) and downstream (Elk-1 and ATF-2) components of the p38 transduction pathway in normal prostate, benign prostatic hyperplasia (BPH), and prostate carcinoma (PC). Immunohistochemical and western blot analyses were performed in 20 samples of normal prostate, 47 samples of BPH, and 27 samples of PC. In all normal prostates, immunoreactivity for p-Elk-1 and p-ATF-2 was observed in epithelial cell nuclei, but no expression of alpha-PAK or MEK-6. In BPH, there was expression of alpha-PAK (cytoplasm) and MEK-6 (cytoplasm), while the proportions of lesions that were immunoreactive for p-Elk-1 (nucleus and cytoplasm) and p-ATF-2 (nucleus) decreased. In PC, the percentages of cells that were immunoreactive for alpha-PAK (cytoplasm) or MEK-6 (cytoplasm) rose slightly in comparison with BPH, while the percentages of cells that were immunoreactive for p-Elk-1 (nucleus and cytoplasm) or p-ATF-2 (nucleus and cytoplasm) were much higher than in BPH. It is concluded that overexpression of alpha-PAK, MEK-6, p38, p-Elk-1, and p-ATF-2 in BPH, and more intensely in PC, enhances cell proliferation. In BPH, such proliferation is triggered by IL-1 and in part counteracted by the TNF-alpha/AP-1 pathway, which promotes apoptosis. In PC, proliferation is triggered by IL-1 and TNF-alpha (the TNF-alpha/AP-1 pathway is diverted towards p38 activation). Since in a study of the same patients immunoexpression of IL-1alpha and IL-1RI was previously observed to be increased in PC, inhibition of p38 is a possible target for PC treatment, as this inhibition would both decrease IL-1-induced cell proliferation and increase TNF-alpha-induced cell death.