不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca2+的影响

目的:探讨不同浓度维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞内Ca2+浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca2+浓度的变化。方法:2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/LVer作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)测定细胞内Ca2+荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果:Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义(P>0.05),Ver可降低RPE细胞内Ca2+荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca2+荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异(P<0.05)。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca2+荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异(P>0.05)。结论:超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca2+荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca2+有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca2+荧光强度无明显作用。     

不同光照形式对豚鼠视网膜色素上皮细胞TGF-β2表达的影响

目的：探讨不同光照形式对豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达转化生长因子-β₂(transforming growth factor β₂,TGF-β₂)的影响。

方法：幼年健康豚鼠(2周龄)10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前3组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后24h采用免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR)检测细胞中TGF-β₂及TGF-β₂ mRNA的表达,分析不同光照形式与效应的关系。

结果：免疫细胞化学法显示各组TGF-β₂表达均为阳性,病理VISTA图像分析软件测量单位面积中平均光密度(optical density,OD)值进行半定量分析,聚焦光组明显高于其它各组,组间比较有统计学差异(F=11.08,P<0.05); RTFQ-PCR法显示,聚焦光组TGF-β₂mRNA表达水平较其它各组明显增加,组间比较有统计学差异(F=133.01,P<0.05)。

结论：不同形式光线可影响豚鼠RPE细胞TGF-β₂表达,以聚焦光最明显。     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

视黄醇脱氢酶5在豚鼠形觉剥夺性近视眼中的表达变化

目的　探讨形觉剥夺性近视（FDM）和正常豚鼠的视网膜色素上皮（RPE）细胞中的视黄醇脱氢酶5（RDH5）基因在转录水平和蛋白水平的表达差异。方法　30只豚鼠随机分为:实验组（15只）,其中,右眼进行遮盖为FDM组（15眼),左眼不遮盖为自身对照组（15眼）;空白对照组（15只）双眼不做任何干预。分别于遮盖前,遮盖1周、2周、3周和4周后检查豚鼠屈光度和眼轴长度。采用免疫荧光染色法检测各组豚鼠RPE细胞中RDH5表达,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组豚鼠RPE细胞中RDH5 mRNA和蛋白的表达变化。结果　遮盖前、遮盖1周后,FDM组、自身对照组、空白对照组三组间豚鼠的屈光度、眼轴长度差异均无统计学意义（均为P>0.05）;遮盖2周、3周、4周后,三组间豚鼠的屈光度、眼轴长度差异均有统计学意义（均为P<0.05）。遮盖2周、3周、4周后,FDM组豚鼠屈光度分别为（1.47±1.41）D、（3.32±1.39）D、（4.63±1.04）D,眼轴长度分别为（7.69±0.24）mm、（7.92±0.09）mm、（8.34±0.15）mm,与空白对照组和自身对照组相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。遮盖4周后,与空白对照组和自身对照组相比,FDM组豚鼠RPE细胞中RDH5 mRNA水平和蛋白水平均明显下调（均为P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,RDH5主要表达于豚鼠RPE层,与空白对照组和自身对照组相比,FDM组豚鼠RPE层RDH5蛋白的平均荧光强度最低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　FDM豚鼠近视眼RPE细胞内RDH5基因在转录和蛋白水平的表达均下调,提示RPE 细胞内RDH5可能在近视的发生发展中扮演了一定的角色。     

血小板源性生长因子对人视网膜色素上皮细胞表达肌动蛋白的影响

目的 观察血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）对培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的影响。 方法 将体外培养的第4～6代人RPE细胞分为无血清组［改良Eagle培养液(Delbecco′s modifi ed Eagle′s medium， DMEM）组］和含有20 g/L小牛血清的DMEM组（2% DMEM组）。每组均分别加入不同浓度（0, 1, 50 ng/ml）的PDGF，采用免疫荧光法定性、定量观察PDGF对人RPE细胞表达α-SMA的影响。 结果 DMEM组中，无PDGF刺激时，α-SMA表达阳性细胞数比率约为40%～50%，荧光强度的平均值为 8.08；加入PDGF（1 ng/ml, 50 ng/ml）刺激后，α-SMA表达阳性细胞数的比率及荧光强度的平均值分别为80%、12.35和90%、17.23。2％DMEM组无PDGF刺激时，α-SMA表达阳性细胞数比率约为85 %，荧光强度的平均值为14.79；经1 ng/ml和50 ng/ml的PDGF刺激后，α-SMA表达阳性细胞数的比率及荧光强度的平均值分别为95%、16.28和100%、21.36。2%DMEM组经50 mg/ml PDGF刺激后的荧光强度约为DMEM组无PDGF刺激的时2.7倍，为2％DMEM组无PDGF刺激时的1.5倍。 结论 PDGF能够促进人RPE细胞表达α-SMA。（中华眼底病杂志，2003，19：201-268）     

豚鼠透镜诱导型近视视网膜色素上皮细胞钙离子的研究

目的激光扫描共焦显微镜（LSCM）检测豚鼠透镜诱导型近视模型视网膜色素上皮（RPE）细胞中Ca2＋,探讨Ca2＋在近视发病中的作用机制。方法取2周龄豚鼠10只,选取1只眼用-10.00D凹透镜诱导成近视模型为实验眼,对侧眼为对照眼。实验前后测各组豚鼠屈光度及眼轴长度（AL）。原代培养豚鼠眼球赤道前部及后极部RPE细胞,用角蛋白、波形蛋白、结蛋白、S-100抗体进行免疫细胞化学检测对培养细胞进行鉴定。对各组豚鼠眼赤道前部及后极部RPE细胞进行Fluo-3/AM负载,利用LSCM测定细胞中Ca2＋的变化。结果豚鼠经过45d的透镜诱导,形成（-6.70±1.93）D的相对近视,AL延长了（1.53±0.31）mm,与诱导前的屈光度和AL相比,差异均有统计学意义（F=10.97,P〈0.05;F=-15.64,P〈0.05）。实验眼前部和后极部RPE细胞Ca2＋的荧光强度明显高于对照眼,差异有统计学意义（P〈0.05）,而实验眼和对照眼各自前部和后极部的RPE细胞Ca2＋的荧光强度比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论在实验性近视形成过程中,RPE细胞中Ca2＋浓度增高。     

视网膜色素上皮细胞体外凋亡过程中钙离子平衡与caspase-3基因表达

目的:研究钙通道拮抗剂-维拉帕米(verapamil,Ver)诱导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡过程中钙离子及凋亡基因caspase-3变化。方法:应用80mg/L的Ver分别作用健康人眼RPE细胞12,24及48h诱导凋亡,设立对照组。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测凋亡基因caspase-3的表达,采用Fluo-3/AM负载技术,MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像系统测定每组20个RPE细胞钙荧光值,并计算RPE细胞内钙浓度([Ca2+]i)。结果:对照组RPE细胞Ca2+荧光分布胞核最强,胞质次之。Ver作用12,24及48h后,细胞内[Ca2+]i明显降低(P<0.01)。对照组RPE细胞可见caspase-3的mRNA有少量的表达。Ver作用12h后,可见caspase-3的mRNA有较高的表达,与对照组比较,具有显著性差异(P<0.01)。随着Ver作用时间的延长,caspase-3的mRNA表达逐渐增强,在48h时有所下降。结论:Caspase-3基因表达上调及RPE细胞内钙离子稳态失调可能在Ver诱导RPE细胞凋亡中起关键作用。     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

蓝光所致人视网膜色素上皮细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系

背景 对蓝光照射所致视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤与细胞内钙离子含量变化关系的深入研究可能对探讨视网膜变性类疾病的发生机制及防治具有重要意义. 目的 建立人RPE细胞蓝光损伤模型,探讨RPE细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系.方法 将人RPE细胞系培养传代,锥虫蓝染色评估细胞活力.第4代人RPE细胞分别用(2000±500) lx蓝光照射3、6、9、12h,终止细胞培养24 h后,采用TUNEL法检测不同时间点细胞的凋亡情况,确定最适宜的光照度.然后将RPE细胞分为无光照组、光照组、硝苯地平组、光照+硝苯地平组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组.除无光照组外,其他各组细胞均用蓝光照射6h,终止细胞培养24h,采用激光扫描共焦显微镜检测细胞内游离钙离子含量,激发光波长为488 nm,发射光波长为505 nm,每组随机选取30个细胞,扫描细胞图像,采用分析软件分析各组细胞内游离钙离子的荧光强度.结果 锥虫蓝染色证实RPE细胞的活力均在90％以上,TUNEL染色和免疫组织化学染色证实光照3h组未见细胞凋亡,而光照后6、9、12h发现不同数量的凋亡细胞.硝苯地平组RPE细胞内游离钙离子荧光强度比无光照组和光照+硝苯地平组低,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组RPE细胞内钙离子荧光强度高于无光照组,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照+硝苯地平组与无光照组相比较,(-)BayK8644组与光照+(-)BayK8644组比较,差异均无统计学意义(P=0.339、0.410). 结论 光照度(2000±500)1x、光照6h、终止培养24 h为建立蓝光照射致人RPE细胞损伤模型的最适合条件.蓝光照射所致的人RPE细胞损伤与细胞内游离钙离子含量增加有关.     

视黄酸对豚鼠离焦性近视眼视网膜色素上皮通透性的调控

背景视网膜视黄酸在离焦性近视形成中起重要作用,但目前尚不清楚其如何通过视网膜色素上皮（RPE）屏障向脉络膜传递近视信号。目的研究全反式视黄酸（atRA）对离焦性近视眼RPE屏障功能的影响。方法21日龄清洁级三色豚鼠30只,用随机数字表法分为正常对照组和离焦组,一6D凹透镜缝合于离焦组豚鼠左眼15d以制备离焦性近视模型,每天光照与黑暗周期为12h／12h。用角膜曲率计测量各组豚鼠的角膜曲率半径,行复方托吡卡胺滴眼液扩瞳检影验光以测量豚鼠眼球屈光度,应用A型超声法测量各组豚鼠的眼轴长度。于造模15d时处死动物并分离视网膜,体外培养RPE细胞并传代,将第3代RPE细胞用于实验,制备视网膜铺片,接种于Millcell—PET微孔滤膜插入式培养池,分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9mol／LatRA培养RPE细胞24h,以加入等体积atRA溶剂的培养孔作为阴性对照,以完全培养基加MTT溶液的无细胞孔作为空白对照。采用MTT比色法检测各组RPE细胞的存活率,用CN10一EVOM2型电阻测量仪测定单层细胞跨上皮电阻（TER）,计算RPE细胞的TER值,采用FM1-43型荧光染色技术检测得出RPE细胞FM1-43阳性荧光染色的相对强度值,评价RPE细胞膜泡运输变化。结果豚鼠模型眼屈光度为（-2．20±O．95）D,对照组为（＋1．15±0．30）D,差异有统计学意义（t=14．57,P〈0．01）;豚鼠模型眼的眼轴长度为（8．24±0．09）mm,明显长于对照组的（7．81±0．05）mm,差异有统计学意义（t=17．20,P〈0．01）。原代培养豚鼠近视眼的RPE细胞,取第3代细胞用于实验。RPE细胞接种于Millcell培养池1周后细胞长满滤膜,呈单层生长。加入atRA干预24h,RPE细胞的存活率随药物浓度的升高而逐渐降低,1×10^-9 mol／LatRA组RPE细胞存活率为93．3％,1×10-8mol／LatRA组为88．2％,1×10-6mol／LatRA组和1×10-7mol／LatRA组的RPE细胞大量死亡。不同浓度atRA组RPE细胞的TER值和RPE细胞FMl_43阳性荧光染色的相对强度值的总体比较差异均有统计学意义（F：43．89,P=0．00;F=26．13,P=0．00）,其中1×10-mo[／LatRA组RPE细胞的TER值为（107．32±9．58）Ω）／cm2,荧光染色强度为55．29±9．79,均明显高于1×10-、1×10-、1×10-mol／LatRA组,差异均有统计学意义（P〈0．05）,FMl_43荧光染色部位主要在RPE细胞的细胞膜和细胞质。结论AtRA能够通过增加豚鼠近视眼RPE的紧密连接功能及膜泡运输改变RPE细胞的屏障功能。     

Src-家族酪氨酸激酶特异性抑制剂对H2O2介导的晶状体上皮细胞Ca2＋内流的影响

目的观察Src-家族酪氨酸激酶（SFK）抑制剂PP1对H2O2诱导的晶状体上皮细胞（LECs）内游离钙离子（Ca2＋）浓度变化的影响。方法用Ca2＋荧光探针Fluo-3/AM负载人晶状体HLE-B3,用激光共焦显微镜观察在不同浓度H2O2刺激后细胞内Ca2＋的荧光强度变化;进一步用0.1nmol/LPP1、0.3μmol/（L·min）过氧化氢酶和DMSO分别预处理细胞,观察在常规Ca2＋、低Ca2＋和高Ca2＋培养基条件下H2O2刺激后细胞内Ca2＋荧光强度的变化,评价PP1对H2O2诱导的LECs内Ca2＋的作用。结果不同浓度H2O2刺激后细胞内游离Ca2＋浓度升高,呈剂量依赖效应。用0.1mmol/LH2O2刺激细胞,在常规Ca2＋培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内Ca2＋荧光强度增长幅度与DMSO组比较分别降低（28.5±4.2）%、（33.8±3.7）%,差异均有统计学意义（q=3.73,P〈0.05;q=4.21,P〈0.05）。在低Ca2＋培养基中,3个组细胞内Ca2＋荧光强度增强均不明显;在高Ca2＋培养基中,PP1组、过氧化氢酶组的荧光强度增加幅度较DMSO组分别降低（13.5±1.8）%和（21.3±2.4）%（q=5.58,P〈0.01;q=7.11P〈0.01）。常规Ca2＋和高Ca2＋培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内Ca2＋荧光强度增长幅度的差异均无统计学意义（q=3.04,P〉0.05;q=2.76,P〉0.05）。结论 SFK特异性抑制剂PP1能有效抑制H2O2诱导的LECs的Ca2＋内流,从而阻断依赖Ca2＋激活的信号转导途径,阻止皮质性白内障的发生。     

光诱导对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

研究人视网膜色素上皮（RPE）细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲 基腺嘌呤（3MA）对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法：实验研究。将体外培养的人RPE细 胞（ARPE-19）随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接 受光照刺激,以自制三基色LED（发光二极管）冷光灯作为光源,在（16 500±500）lx光照强度下照 射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共 聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、 LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果：在光照12 h后,ARPE-19细胞自 噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率（F=931.53,P<0.001）;光照24 h后细胞自噬水平超过其正 常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（F=1156.67,P<0.001）;使用3MA可抑制光诱导 的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率（F=2.856,P=0.027）,进而保护细胞以应对光损伤。结论： ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬 可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。     

全反视黄酸对豚鼠视网膜色素上皮细胞分2泌TGF-β2及细胞内第二信使IP3和cAMP的影响

目的观察全反视黄酸（ATRA）对培养的豚鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖以及分泌转化生长因子p2（TGF—β2）的影响，并观察细胞内第二信使cAMP和IP3的含量变化。方法培养原代豚鼠RPE细胞，传2代后用于实验。实验分3组进行。第1组用不同浓度ATRA（5×10^-6、10×10^6、40×10^-6mol／L）作用于豚鼠RPE细胞，24h后用MTT法检测细胞增殖情况。第2组加入10×10^-6mol／L的ATRA．分别于2、4、6、8、16h后收集培养液，用ELISA方法检测RPE细胞TGF—β2的分泌量。第3组以10×10^-6mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞．分别于0min、5min、30min、2h、6h后收集细胞裂解液。行放射免疫和ELISA方法检测细胞内cAMP和IP3的含量变化。每组均以等量溶剂DMSO作为对照。对不同浓度ATRA组间MTT结果行方差分析，其余实验组与对照组间比较行配对t检验。结果5×10^-6、10×100、40×100mol／LATRA作用RPE细胞24h后，DD值分别为0．099±0．008、0．117±0．008、0．087±0．011。与对照组（0．103±0．017）比较，40×10^-6mol／LATRA作用时OD值显著降低，差异有统计学意2（P〈0．05），其他浓度组与对照组相比差异无统计学意义（p〉0．05）。10×10^-6／mol／L的ATRA作用RPE细胞后，TGF—β2的分泌量在作用2、4、6h时较对照组明显升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）．8h时无明显变化，16h时降低（P〈O．05）。10×10^-4mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞后，IP3的含量在各时间点均较对照组显著下降，且随时间的延长下降越明显；cAMP的含量只有在作用30min和2h时升高．其他时间变化不明显。结论浓度为40×10^-6mol／L的ATRA对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用。10×10^-6mol／L的ATRA作用RPE细胞后．TGF-β2的分泌量在6h内增加，之后随时间延长而降低。ATRA对RPE细胞的作用可能与IP3的下降有关。     

全反视黄酸对豚鼠视网膜色素上皮细胞分泌TGF-β2及细胞内第二信使IP3和cAMP的影响

目的 观察全反视黄酸(ATRA)对培养的豚鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖以及分泌转化生长因子β2(TGF-β2)的影响,并观察细胞内第二信使cAMP和IP3的含量变化.方法 培养原代豚鼠RPE细胞,传2代后用于实验.实验分3组进行.第1组用不同浓度ATRA(5×10-6、10×10-6、40×10-6 mol/L)作用于豚鼠RPE细胞,24 h后用MTY法检测细胞增殖情况.第2组加入10×10-6 mol/L的ATRA.分别于2、4、6、8、16 h后收集培养液,用ELISA方法检测RPE细胞TGF-β2的分泌量.第3组以10×10-6 mol/L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞,分别于0 min、5 min、30 min、2 h,6 h后收集细胞裂解液,行放射免疫和ELISA方法检测细胞内cAMP和IP3的含量变化.每组均以等量溶剂DMSO作为对照.对不同浓度ATRA组间MTT结果行方差分析,其余实验组与对照组间比较行配对t检验.结果 5×10-6、10×10-6、40×10-6 mol/L ATRA作用RPE细胞24 h后,OD值分别为0.099±0.008、0.117±0.008、0.0871±0.011.与对照组(0.103±0.017)比较,40×10-6 mol/L ATRA作用时OD值显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),其他浓度组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).10×10-6 mol/L的ATRA作用RPE细胞后,TGF-β2的分泌量在作用2、4、6 h时较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).8 h时无明显变化,16 h时降低(P<0.05).10×10-6 mol/L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞后,IP3的含量在各时间点均较对照显著下降,且随时间的延长下降越明显;cAMP的含量只有在作用30 min和2 h时升高,其他时同变化不明显.结论 浓度为40×10-6 mol/L的ATRA对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用.10×10-6 mol/L的ATRA作用RPE细胞后,TGF-β2的分泌量在6 h内增加,之后随时间延长而降低.ATRA对RPE细胞的作用可能与IP3的下降有关.     

全光谱光照对体外培养的人视网膜色素上皮细胞分泌多巴胺功能的影响

目的 探索不同光谱组成的光照射对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌多巴胺功能的影响.方法 实验研究.在细胞培养箱内建立光照系统后,将体外培养的RPE细胞分别放置于无光照（对照组）、全光谱低强度光照、红绿蓝（RGB）光谱低强度光照、全光谱高强度光照、RGB光谱高强度光照环境中进行培养,连续光照24、48 h后进行检测.利用WST-1法检测各处理组之间RPE 细胞增殖率的改变,用高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺分泌水平.用one-way ANOVA对实验数据进行统计学分析.结果 WST-1检测结果显示：连续光照24h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB 光谱光照对RPE细胞增殖率的影响差异无统计学意义：而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞增殖率低于RGB光谱光照组（P＜0.05）.连续光照48 h后,无论在哪种光照强度下,全光谱光照比RGB光谱光照更能抑制RPE细胞的增殖（P均＜0.01）.HPLC检测结果显示：连续光照24 h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB光谱光照相比,对RPE细胞分泌多巴胺功能的影响差异无统计学意义;而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P＜0.01）.连续光照48 h后,同一光照强度下,全光谱光照组RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P均＜0.05）.结论 光的光谱组成也是调控RPE细胞分泌多巴胺的重要因素之一,这种调控作用与光照强度和光照时间密切相关.在评估光延缓近视发生发展的作用时应该考虑光的光谱组成.     

吡哆胺对AGEs干预的人RPE细胞的保护作用

目的：观察吡哆胺(PM)对高级糖基化终末产物(AGEs)干预的RPE细胞的影响,探讨PM对RPE细胞的保护作用。

方法：取传代至第3代的细胞进行分组：(1)对照组：含100mg/L BSA的DMEM培养基培养48h;(2)AGEs干预组：含200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h;(3)PM组：PM1组：含16mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h; PM2组：含32mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h。采用免疫组织化学法检测RAGE蛋白的表达; 荧光染色法观察细胞内ROS的生成; Tunel法检测细胞凋亡情况。

结果：AGEs可明显刺激RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS的生成,增加细胞凋亡情况,而PM可抑制该过程,且具有一定的浓度依赖性。

结论：PM能够抑制AGEs干预的RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS生成,减少细胞凋亡,具有一定的细胞保护作用。     

U73122和SQ22536对视网膜色素上皮细胞增生及分泌TGF-β_2的影响

目的观察磷脂酶C（PLC）抑制剂U73122和腺苷酸环化酶（AC）抑制剂SQ22536对豚鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞增生及分泌转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响。方法胰蛋白酶消化法培养原代豚鼠RPE细胞,角蛋白免疫组织化学染色鉴定为阳性后,传2代细胞用于实验。实验组加入含不同浓度U73122或SQ22536的培养液,设溶剂对照。24h后观察RPE细胞形态,噻唑蓝（MTT）法检测加入不同浓度U73122后RPE细胞的增生情况。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测1×10-5mol/LU73122及SQ22536作用2、4、6、8、16h后细胞培养液中TGF-β2的分泌量。结果培养的RPE细胞通过角蛋白染色后呈棕黄色阳性反应。MTT法检测显示,U73122实验组中除5×10-6mol/L浓度组外,其余各浓度组OD值与对照组比较均显著下降,且随着浓度的增加,OD值下降越明显（P〈0.05）;SQ22536各浓度组与对照组OD值相比差异均无统计学意义（F=1.316,P〉0.05）。ELISA结果显示,加入1×10-5mol/LU73122后2h实验组TGF-β2的分泌量与对照组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,4、6、8、16h后,实验组较对照组及2h组均明显增加（P〈0.05）;而SQ22536组RPE细胞TGF-β2的分泌量在2、4、6、16h比较差异无统计学意义（P〉0.05）,8h时分泌量降低。结论 PLC抑制剂U73122能抑制RPE细胞的增生,并可使RPE细胞分泌TGF-β2增加。AC抑制剂SQ22536对RPE细胞的生长和TGF-β2的分泌无明显影响。提示RPE细胞分泌TGF-β2的调控可能与PLC信号转导途径有关。     

维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及细胞内钙变化

目的:探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelium,hRPE)细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2 ]i的变化。方法:应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12,24及48h,采用吖叮橙(AO)荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡;Fluo-3/AM负载技术,观察凋亡过程中细胞[Ca2 ]i的变化。结果:一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡,荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征:核荧光呈黄绿色,电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示,Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加(F=12.3415,P<0.05)。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度([Ca2 ]i)呈下降趋势(F=23.607,P<0.01)。结论Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡,细胞内[Ca2 ]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。     

不同波长的光照射对视网膜色素上皮细胞生长及其分泌生长因子的影响

背景近视的发病机制是眼科研究的一个热点,近年来发现,由神经视网膜细胞及视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌的细胞因子可能参与近视的发病,RPE细胞因子的分泌功能受光照射的影响,而RPE细胞对不同波长光的吸光度（A）值是不一样的。目的研究不同波长的光照射对人胚RPE细胞增生及其分泌肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bVGF）和转化生长因子-β（TGF—β）的影响,从细胞水平和分子生物学水平探讨近视的发病机制。方法第4～5代人胚RPE细胞置于白光、波长为775nm的红光及波长为480nm的蓝光下照射和培养48h,MTT比色法检测各组人RPE细胞的增生情况,并用透射电子显微镜观察各组传代细胞的超微结构。分别于光照射后12、24、48、72h收集培养液,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定培养基中HGF、bFGF和TGF—β的质量浓度。用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测不同波长光照射24h后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平,分析蓝光、红光、白光照射对体外培养RPE细胞的影响。结果蓝光组、红光组、白光组和对照组RPE细胞的A490值分别为0．0218±0．0014、0．0353±0．0025、0．0371±0．0024和0．0445-0．0046。4个组中RPE细胞的增生速度明显不同,差异有统计学意义（F=12．579,P〈0．05）,蓝光组和红光组A490值均明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=2．043、t=2．024,P〈0．05）。ELISA结果显示人胚RPE细胞可以分泌HGF、bFGF和TGF-β,在受到不同波长的光照射后,不同时间点HGF、bFGF和TGF—β的分泌量不同,随着时间的变化,4个组HGF、TGF—β的质量浓度均逐渐升高,二者在72h和48h均高于12h（P〈0．05）,红光组与蓝光组更为明显,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。各波长组bFGF的质量浓度随着光照时间的延长在RPE细胞中的表达均逐渐降低,72h与12h时相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR结果显示,不同波长光照射后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平不同,蓝光下培养的RPE细胞HGFmRNA表达量最少,白光组、红光组和蓝光组HGFmRNA的表达量（A490）与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。透射电子显微镜下红光组、白光组人胚RPE细胞与对照组相比超微结构均无明显变化,但蓝光组RPE细胞核染色质稀疏变淡,细胞器减少,细胞界膜不清或消失。结论不同波长的光照射可影响人RPE细胞的增生及其分泌HGF、bFGF和TGF—β的功能,提示近视的形成可能与不同波长的光相互作用有关。