微囊化和基因修饰的肝细胞移植--人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究

构建人肝再生增强因子原核融合表达载体，并对表达产物进行生物活性研究，从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据，并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法：以pGEM-T-hALR为模板，应用PCR技术扩增出hALRcDNA，克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-2，限制性内切酶酶切及测序证实序列正确；转化大肠杆菌JM109：桃取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST－hALR，融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体；采用^3H-thymidine渗入法检测hALr单体的生物学活性。结果：以pGEM-T-hALR为模板，行PCR扩增后，产物于1．5％琼脂糖凝胶电泳分析，可见380bp特异性条带，符合hALRcDNA阅读框架的大小。构建融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，经限制性内切酶酶切分析，与理论值相符，测序融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，经限制性内切酶酶切分析，与理论值相符，测序证明序列正确，片段为正向插入。重组表达质粒转化人肠杆菌JM109。SDS－PAGE电泳分析显示重组菌在约41KD处出现一蛋白条带。纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S－转移酶约26KD，hALR约15KD。薄层扫描蛋白电泳结果表明，表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的31％。纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2细胞培基，细胞DNA合成率较对照组均有显著提高（P＜0．01）。结论：成功构建融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，限制性内切酶酶切及序列测定证明载体插入正确，并成功转化大肠杆菌JM109得阳性克隆。采用含融合蛋白GST的原核表达载体pGEX-4T-2表达hALR，其突出优点在于表达产率高；重组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中，融合蛋白的分离纯化筛单易行。纯化分离后所得hALR能刺激体外培养的原代鼠肝细胞、HepG2细胞DNA合成，具有生物活性。     

人肝再生增强因子DNA免疫的实验研究

目的:构建人肝再生增强因子()真核表达质粒,免疫家兔,获得抗多抗血清。hALRhALR方法:将已构建的人肝再生增强因子()重组质粒,经扩增,亚克隆入真核表达质粒,构建重hALR PET11-hALRPCR pcDNA3.1 pcDNA3.1-hALR组质粒。中量制备重组质粒及对照质粒,以只免疫家兔,取血并分离血清,进行蛋白质pcDNA3.1-hALR pcDNA3.11.08mg/印迹分析。Western blot结果:构建了真核表达质粒,此重组质粒诱发了家兔抗抗体的产生。pcDNA3.1-hALRhALR结论:说明构建的重组质粒在体内有表达能力,为进一步研究的生物学活性及某些疾病的治疗奠定了基础。 hALR     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的 克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列,并在原核细胞表达。方法 按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT－PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片段亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果 从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质,与预期值一致。结论 从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

RT-PCR一步法克隆人肝再生增强因子基因

目的 采用RT－PCR一步法，克隆人肝再生增强因子（hALR）编码序列。方法 按文献报道人肝再生增强因子核苷酸序列合成引物，提取人胎肝组织总RNA，利用一步RT－PCR法扩增人肝再生增强因子编码区基因；将PCR扩增片断克隆到pBV221质粒，构建原核表达载体。结果 获得长约400bp的hALPcDNA编码区基因，序列分析表明与文献报道一致。结论 通过RT－PCR一步法成功克隆人肝再生增强因子基因，为制备人ALR基因工程产品及研究其多种生物学作用奠定了基础。     

大鼠肝脏再生增强因子cDNA的克隆及其序列分析

目的：克隆大鼠肝脏再生增强因子（ALR）cDNA,并对其序列进行分析。方法：建立大鼠2/3肝切除模型,从再生肝组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出大鼠ALRcDNA,亚克隆于pGEM-T载体,并将DNA序列及其推测的氨基酸序列与Genebank作同源性比较。结果和结论：克隆到大鼠ALRcDNA,经核苷酸序列测定证实序列完全正确,其核苷酸序列没有任何突变,它与酵母ERV1cDNA有较高的同源性,核苷酸序列同源性达54.99％,氨基酸序列同源性达47.01％,并发现氨基酸序列中含有锌指蛋白结合区域。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

重组脂联素真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建重组人脂联素(ADPN)真核表达质粒,为进一步研究ADPN的功能提供实验基础.方法应用限制性内切酶双酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD 18-T和真核表达质粒pcDNA 3.1 ,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定.结果重组真核表达质粒经HindⅢ、EcoRⅠ酶切后获得5.4 kb和800 bp两个片段,大小与理论值一致,并经核苷酸序列测定证实.结论成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

Expression of GST-IL-1 fusion gene

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＳＴ－ＩＬ－１ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅＣｈｅｎＭｅｉｈｏｎｇ（陈梅红）；ＷａｎｇＺｉｌｉｎｇ（王字玲）；ＤｅｎｇＪｉａｎｂｅｉ（邓健蓓）；ＺｈａｏＺｈｏｎｇｌｉａｎｇ（赵忠良）；ＣｈｅｎＮａｎｃｈｕｎ（陈南春）；ＳｕＣｈｅｎｇｚ...     

人氨肽酶N基因克隆和原核表达

目的：构建人氨肽酶N(APN)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(APN-GST)，并进行原核表达。方法：根据人APN mRNA序列设计合成特异性引物，从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链，RT-PCR扩增人APN基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T，转化宿主菌BL21(DE3)细胞，异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白。包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化。结果：重组质粒测序和酶切结果显示：APN基因已正确插入pGEX-4T，重组蛋白及纯化产物SDS-PAGE在135000处有一条明显的蛋白表达条带。结论：人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化。     

人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1)cDNA,构建原核表达质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并诱导表达谷胱甘肽疏基转移酶-hGLP-1(GST-hGLP-1)融合蛋白。方法：采用亚磷酸二酯法合成6个hGLP-1cDNA的寡核苷酸片段,拼接成完整的hGLP-1cDNA,克隆至pBSSK( /-)载体中,经双酶切鉴定和测序后把hGLP-1cDNA定向插入融合基因表达体pGEX-4T-3的多克隆位点上,构建重组质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并转化大肠杆菌TG1。结果：经限制性内切酶合蛋白GST-hGLP-1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hGLP-1创造条件。     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

骨桥蛋白融合蛋白的原核表达

目的：研究骨桥蛋白（Osteopontin ,OPN ）的作用及机制,探索可大量制备OPN的方法。方法利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转入大肠杆菌诱导表达GST-0PN融合蛋白。结果成功得到pGEX-4T-1-0PN表达载体且顺利获得大量融合蛋白。结论利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中可以制备大量OPN蛋白。     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.