福建省人感染HSN1禽流感病毒血凝素基因测定和分析

目的了解我省人感染高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因的特点以及和其他毒株序列间的关系。方法从采集自两例福建省感染者的标本中扩增H5N1禽流感病毒血凝素基因并作序列测定，获得的序列同其他H5N1禽流感病毒的血凝素基因进行比较并作进化分析。结果获得福建省的两例感染者中的H5N1禽流感病毒血凝素基因，并推导出该基因的氨基酸序列。结果表明，两株病毒的血凝素基因在蛋白酶水解位点均含有多个连续的碱性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒的特征。经Blast程序检索发现，我省两例感染者与国内其他省份的感染者携带的病毒血凝素基因具有很高的相似性，提示国内的H5N1禽流感病毒感染者的病毒来源可能有一定的关系。结论通过对两例福建省感染者标本中的H5N1禽流感病毒血凝素基因进行序列测定，了解病毒基因的部分特点。通过序列比较分析为分子流行病学调查提供线索，但还需对其他基因序列以及病毒的致病性等生物学特征作进一步分析。     

福建省人感染H5N1禽流感病毒血凝素基因测定和分析

目的了解我省人感染高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因的特点以及和其他毒株序列间的关系。方法从采集自两例福建省感染者的标本中扩增H5N1禽流感病毒血凝素基因并作序列测定,获得的序列同其他H5N1禽流感病毒的血凝素基因进行比较并作进化分析。结果获得福建省的两例感染者中的H5N1禽流感病毒血凝素基因,并推导出该基因的氨基酸序列。结果表明,两株病毒的血凝素基因在蛋白酶水解位点均含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。经Blast程序检索发现,我省两例感染者与国内其他省份的感染者携带的病毒血凝素基因具有很高的相似性,提示国内的H5N1禽流感病毒感染者的病毒来源可能有一定的关系。结论通过对两例福建省感染者标本中的H5N1禽流感病毒血凝素基因进行序列测定,了解病毒基因的部分特点。通过序列比较分析为分子流行病学调查提供线索,但还需对其他基因序列以及病毒的致病性等生物学特征作进一步分析。     

H5N1禽流感病毒抗原基因的体外转录及RNA标准品构建

目的 通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M(M)基因的RNA片段,为病原学检测提供阳性定量标准品.方法　设计H5N1禽流感病毒的HA、NA及M基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA,用RT-PCR获得相应片段,分别连接至Pgem-T easy...     

2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

目的 分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征.方法 从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本,利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序,病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析,利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids,aa)比对.结果 从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33％),其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒,进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内,聚集形成一个新亚分支,NA及NS基因位于2.3.2.lb亚分支.HA蛋白受体结合位点aa为QSG,表现为禽流感病毒受体特征;NA蛋白未出现H275Y及N295S aa替换,对神经氨酸酶抑制剂敏感;HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征.结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征,但不具有对人易感的受体特征,需要进一步监测.     

荧光定量RT—PCR方法检测感染小鼠不同组织中的HSN1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量，了解病毒复制与疾病进程的关系，为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB／c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测，观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸；而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降；在感染后第6d，H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外．其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高，说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量，可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

禽流感病毒血凝素基因研究进展

血凝素在禽流感病毒感染细胞过程中起到了关键作用,对血凝素基因的相关研究一直是禽流感研究的重点和热点。文章从禽流感病毒简介,血凝素基因的结构特点,血凝素基因编码的蛋白质结构与功能,血凝素裂解位点的研究情况等方面进行了综述。可以为禽流感的预防和治疗提供参考。     

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。     

H5N1亚型和H3N2亚型禽流感病毒广西株NS基因的克隆和序列分析

目的对3株分离自广西的禽流感病毒的NS基因进行序列分析,试图从分子水平分析和了解广西地区禽流感病毒NS基因的变异特点和进化规律。方法根据GenBank上登录的已知禽流感病毒的NS基因全序列设计引物,对3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株A/DK/GX/1566/04(H3N2)、A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)的cDNA进行PCR扩增NS基因,并将其克隆到pMD-18T载体上,分别获得全长为855bp、834bp、837bp的NS基因全序列。结果2株H5N1亚型禽流感病毒广西株间NS基因序列的同源性为95.3%,而2株H5N1亚型禽流感病毒株与H3N2亚型禽流感病毒株之间NS基因序列的同源性为94.0%～94.1%。H5N1亚型禽流感病毒广西株的NS基因在第238-253位核苷酸处均发生了15个核苷酸缺失,与我国广东、香港、云南、湖南、湖北及东南亚等不同地区的毒株比较,NS基因的核苷酸同源性为70.2%～97.6%。在NS基因系统进化树中,3株禽流感病毒广西株都属于A亚群,但处在不同的分支上,其中A/DK/GX/1566/04(H3N2)与广东、香港2001-2003年分离株处于同一分支;A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)与我国华南地区以及韩国、越南、泰国等亚洲东南部国家的2003年以后的分离株有共同起源。结论3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株NS基因之间的同源性均高于94%,都属于A亚群。     

构建携带大鼠脑红蛋白基因慢病毒载体及其目的基因高效表达

目的 构建携带大鼠脑红蛋白（rat neuroglobin,rNGB）基因的慢病毒真核表达载体pLenti6/V5-rNGB,转染293细胞,观察外源性NGB在293细胞中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从大鼠脑组织中获得rNGB基因片段,重组到pLenti6/V5慢病毒真核表达载体上.pLenti6/V5-rNGB经病毒包装,转染至293细胞,而后行rNGB Western blot和免疫细胞化学检测.结果 PCR扩增序列为456bpNGB基因,用Xho-Ⅰ和BamH-Ⅰ进行双酶切显示NGB序列已插入pLenti6/V5慢病毒表达载体,DNA序列鉴定进一步证实插入基因片段的正确性;293细胞转染pLenti6/V5-rNGB后荧光显微镜下发出绿色荧光,证实慢病毒表达载体转入包装细胞;进一步采取Western blot方法和免疫组化方法证实rNGB在包装细胞内有效表达,而pLEGFP-NI转染的细胞只检测到NGB蛋白微弱表达,两组比较有统计学差异（相对表达量分别为25.32±1.05、0,t=-39.63,P〈0.01）.结论 构建的pLenti6/V5-rNGB,经病毒包装转染至293细胞,rNGB和EGFP基因在细胞内有效表达,为pLenti6/V5-rNGB治疗相关疾病的实验研究奠定了基础.     

原位转导胞嘧啶脱氨酶自杀基因对大肠肿瘤的杀伤作用

目的通过胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因对接种于裸鼠肿瘤的直接杀伤作用研究，探索原位转自杀基因抑制大肠肿瘤的治疗方法。方法 将含ＣＤ基因的逆转录病毒载体进行包装，收获病毒上清后，将含ＣＤ基因的重组病毒上清直接注射到患病部位。结果 在给予前药５－ＦＣ后，观察到明显的肿瘤杀伤作用。结论ＣＤ基因直接转导到肿瘤部位的治疗结果，提示其可以做为大肠癌综合治疗的有效手段之一。     

科学家发现H5N1型禽流感病毒变异速度惊人

据中国网10月15日报道，在一名越南患身上的H5N1型禽流感病毒毒株中，美国、日本和越南研究人员发现了一些毒株对目前最有效的流感药物“达菲”已具有抗药性。科学家警示，禽流感病毒的变异速度大大超出人们的想象，各国绝不能单纯依赖达菲。     

禽流感病毒变异迅速 疫苗可能失效

据医学空间网2月17日报道，禽流感病毒出现了带有地区特征的分支，这意味着各国仅根据一个病毒分支研制出的人用疫苗很可能无效。科学家们从中国香港和内地的家禽、候鸟的1万多份分泌物中，提取出H5N1型禽流感病毒样本，并和东南亚等其他地区的病毒样本进行基因比较。他们发现，这些病毒都源自1996年出现在中国广东的原始H5N1型病毒，但现在不同地区禽鸟身上的病毒基因已经发生变异，分化成了带有地区特征的分支。     

广东省活禽市场外环境重配H3N2亚型禽流感病毒污染调查

目的了解2017-2018年广东省活禽市场外环境中H3N2亚型禽流感病毒的污染和变异情况。方法于2017-2018年在广东省禽流感监测点采集环境样品进行核酸检测,阳性样品接种鸡胚分离病毒并进行全基因组测序,利用相关软件进行生物信息学分析。结果成功获得7株H3N2亚型禽流感病毒,其HA蛋白裂解位点序列均为PEKQTR↓GL,与典型低致病性禽流感病毒的序列特征相符合。其中一分离株NS基因发生D92E干扰素抗性突变。HA蛋白受体结合位点、神经氨酸酶耐药位点、M基因上的金刚烷胺类药物耐药位点、PB2基因上与哺乳动物适应性相关位点等均未发生突变。系统进化分析显示,7株分离株的8个基因片段均处在欧亚禽源分支中,但相互间存在差距。结论 7株分离株中存在5种组合的重配H3N2亚型禽流感病毒,其中1株NS基因发生D92E干扰素抗性突变。因此应加强活禽市场及环境监测,防止产生能在人群中流行的重配H3N2病毒。     

荧光定量RT-PCR方法检测感染小鼠不同组织中的H5N1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量,了解病毒复制与疾病进程的关系,为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测,观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸;而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降;在感染后第6d,H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外,其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高,说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量,可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

红细胞富集与多重RT-PCR联合检测禽流感病毒

目的对禽流感病毒H5、H7亚型进行更快速、更灵敏检测。方法根据禽流感病毒(AIV)核蛋白基因和血凝素基因设计3对特异性引物,建立在结合红细胞富集AIV病毒的基础上进行多重RT-PCR检测方法。结果该方法在1个反应体系中不仅能够鉴定A型流感病毒,而且可以同时确定是否为H5和H7亚型AIV;该方法的检测下限可达2.5pg的病毒RNA;对于参考毒株都可以扩增出预期大小的基因片段,而对新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的平行对照结果均呈阴性。结合AIV能够吸附鸡红细胞并在一定条件下解离的特点,利用鸡红细胞对48份已确诊样品进行病毒富集,然后用建立的多重RT-PCR方法检测富集产物结果显示48个样品中,30个为H5亚型AIV阳性,与病毒分离结果完全一致。结论由以上结果初步表明本研究建立的检测方法快速,特异,在禽流感临床筛检中显示出良好的应用前景。     

2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒分子特征和遗传进化分析

目的 分析2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型禽流感病毒的分子特征和遗传进化特点，为禽流感防控提供参考依据。方法 对2018-2019年福建省禽类外环境H5亚型单阳性标本进行复核，筛选出Ct值小于30的标本，对HA和NA基因进行靶向扩增和二代测序，从NCBI和GISAID数据库下载参考序列，使用生物信息学软件分别对HA和NA基因进行分子突变位点和遗传进化分析。结果 共完成12株H5亚型HA和NA全基因测序。序列比对结果显示，HA基因最高一致性在98.59%～99.89%,NA基因最高一致性在98.19%～99.85%。遗传进化分析显示，HA基因归属于Clade 2.3.4.4h分支，NA基因归属于欧亚谱系H5N6和H6N6分支。12株毒株的裂解位点均为高致病性禽流感病毒分子特征，受体结合位点为禽源受体，但S123P、S133A、I151T、T156A突变可增强病毒与人源受体的亲和力。HA基因糖基化位点分析显示，常见154位糖基化位点缺失，在124位(-NHTS)新增潜在糖基化位点。结论 2018-2019年福建省禽类外环境中存在Clade 2.3.4.4h进化分支H5N6高致病...     

禽流感转变为大流行毒株过程复杂

据Medscape．com7月31日报道（原载Proc Natl Acad Sci USA2006），H5N1型禽流感病毒和人流感病毒之间基因的一个简单交换还不足以成为引起有效的人间传播和导致该病毒大流行的原因。     

禽流感病毒特异性NP单克隆抗体的鉴定及禽流感特异性检测方法的建立

目的筛选鉴定禽流感病毒特异性单克隆抗体(单抗)并建立一种适合禽源流感病毒特异性检测的抗原检测方法。方法利用分子进化树分析方法对甲型流感病毒核蛋白(NP)基因进行分类,从禽流感病毒分支和人流感病毒分支上各挑选一个代表性流感病毒株的NP基因进行重组抗原的表达及其单抗的筛选制备,最后应用免疫渗滤技术(A-Dot-ELISA)建立抗原快速检测方法。结果根据分子进化树分析结果确定禽流感H5N1病毒株HK/212/2003和人流感H1N1病毒株CA/04/2009的NP基因进行原核表达,获得高纯度的禽流感病毒NP重组抗原rNP-HK/212和人流感病毒NP重组抗原rNP-CA/04;利用上述两种NP抗原制备出抗rNP-HK/212单抗53株,通过差异筛选获得只对禽流感病毒NP蛋白rNP-HK/212有特异性反应而不与人流感病毒NP反应的3株单抗(1F2,5D2及25A2);免疫荧光方法证实1F2等3株单抗只特异识别禽流感病毒;利用单抗1F2成功建立一种适于禽流感病毒特异性检测的抗原快速检测方法 AIV-Dot-ELISA,该方法对病毒滴度为0.025~0.1HA titer的19个不同亚型的禽流感病毒均能检出,对病毒滴度为5HA titer的8个人流感病毒和2个乙型流感病毒的检测均为阴性。结论本研究成功制备出禽流感病毒NP蛋白特异性单抗,并建立了一种仅特异识别禽流感病毒的抗原快速检测方法 AIV-Dot-ELISA,为快速鉴别禽类流感病毒和人类流感病毒感染提供了一种有用的分析检测工具。     

福建省人感染H5N6禽流感病毒与外环境禽流感病毒相关性分析

目的 分析福建省外环境H5亚型禽流感病毒分布情况及与人感染H5N6禽流感的关系,为人感染禽流感的科学防治提供依据。方法 收集2013-2017年福建省外环境常规监测标本信息,进行统计分析。从数据库下载相关禽流感病毒基因序列,进行基因同源性比对和系统进化分析。结果 外环境监测结果统计分析显示:2013-2017年共采集样本4 903份,H5亚型阳性率为4.24%,且不同的网络实验室(χ²=101.033)、监测场所(χ²=45.526)、标本类型(χ²=31.751)和季节(χ²=48.174)阳性率均存在统计学差异(P<0.05)。福建省首例人感染H5N6禽流感(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)病毒全基因序列与6株福建省外环境H5N6病毒的同源性在85.1%~98.5%,与病家院中采集的1株加强监测外环境标本的HA和NA基因同源性分别为100.0%和99.9%。系统进化分析显示:福建省人感染H5N6病毒HA基因与加强监测的外环境H5N6病毒的进化距离最近,与其余6株距离较远,处在不同的进化分枝中,其基因源于H5N8病毒;而NA基因则与7株外环境H5N6病毒的进化距离较近,源于H5N6病毒。结论 福建省冬春季外环境中禽流感活动较为活跃,应加强活禽交易市场的卫生管理工作。福建省发现的首例人感染H5N6禽流感与外环境禽流感病毒的重配可能存在一定的相关性。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白的原核表达与鉴定

目的原核表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒核蛋白(nuclear protein,NP)。方法从H5N1A/meerkat/Shanghai/2012(SH-1),2.3.2.1中提取总RNA,反转录为cDNA后采用PCR扩增NP基因,构建重组质粒经双酶切、测序鉴定正确后转入BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白的表达,纯化后进行结合活性鉴定。结果构建的重组质粒H5N1NP经双酶切及测序鉴定正确,转化入大肠埃希菌后表达NP蛋白,SDS-PAGE分析其相对分子质量为70×103,与理论值相符。ELISA法检测NP蛋白与相应抗体具有结合活性。结论实现了禽流感病毒H5N1NP重组蛋白的原核表达,表达蛋白具有结合活性,为进一步研究NP蛋白的功能和诊断用单抗的研发奠定了基础。