高浓度葡萄糖对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因的影响

目的：观察高浓度葡萄糖体外对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。探讨葡萄糖毒性及其分子机制。方法：应用TUNEL法检测高浓度葡萄糖培养后大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3细胞凋亡百分率；应用定量RT-PCR（QRT-PCR1）检测培养后大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3细胞bcl-2和baxmRNA的表达；应用定量RT-PCR检测低剂量链脲佐菌素糖尿病大鼠胰岛bcl-2和baxmRNA的表达。结果：高浓度葡萄糖使原代培养的大鼠胰岛细胞和βTc-3的凋亡细胞比例明显增加；胰岛细胞凋亡过程中。诱导凋亡基因bax的mRNA表达水平明显升高，抵抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达水平明显下降．致使bcl-2／bax比率明显降低；对低剂量链脲佐菌素糖尿病大鼠胰岛凋亡相关基因QRT-PCR检测也显示同样的结果。结论：高浓度葡萄糖可能通过诱导胰岛细胞凋亡增加而加重糖尿病。其中bcl-2／bax mRNA表达比率变化可能起重要作用。     

胰淀素对胰岛细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的：观察胰淀素对胰岛细胞凋亡和凋亡相关基因表达的影响。方法：应用放免法检测胰淀素培养后大鼠胰岛细胞和胰岛β细胞瘤细胞系(βTc3)高糖刺激后上清液的胰岛素水平；应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测胰淀素培养后大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3细胞凋亡百分率；应用定量RT-PCR(QRT-PCR)检测培养后bcl-2、bax mRNA的表达。结果：胰淀素使原代培养的大鼠胰岛细胞和βTc3胰岛素分泌功能明显下降，使原代培养的大鼠胰岛细胞和βTc3的凋亡细胞比例明显增加；胰岛细胞凋亡过程中，诱导凋亡的基因bax mRNA表达水平明显升高，抵抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达水平明显下降。结论：胰淀素可能通过诱导胰岛细胞凋亡导致或加重糖尿病，其中bcl-2／bax mRNA表达比率变化可能起重要作用。     

高浓度游离脂肪酸对胰岛细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的：观察高浓度游离脂肪酸体外对胰岛细胞凋亡和凋亡相关基因表达的影响。方法：应用TUNEL法检测高浓度游离脂肪酸培养后大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3细胞凋亡百分率，应用定量RT～PCR(QRT—PCR)检测培养后bc1-2、bax、c—myc、p53和fas mRNA的表达。结果：高浓度游离脂肪酸使原代培养的大鼠胰岛细胞和βTc3的凋亡细胞比例明显增加。胰岛细胞凋亡过程中，诱导凋亡基因bax、c—myc、fas的tuRNA表达水平明显升高，抵抗凋亡基因bcl-2mRNA表达水平明显下降，p53 mRNA表达水平无明显改变。结论：游离脂肪酸可能通过诱导胰岛细胞凋亡导致或加重糖尿病，其中bc1-2／bax mRNA表达比率变化可能起重要作用。     

大鼠胰岛细胞原代培养模型的研究

目的：建立一种客观的用于糖尿病和降血糖药物研究的大鼠胰岛细胞原代培养模型。方法：大鼠胰腺经胶原酶消化后，利用细胞贴壁时间、紧密程度及存活时间的差异，获得较为纯净的胰岛细胞。通过胰岛素含量测定，葡萄糖刺激实验及移植实验评价该细胞的功能。结果：分离得到的胰岛细胞成活率可达95％以上；双硫腙染色表明大部分细胞团为含有β细胞的胰岛细胞团；经RPMI 1640培养的细胞，其上清及细胞内的胰岛素含量均高于DMEM组，且对葡萄糖刺激的敏感性优于DMEM组：培养的胰岛细胞移植入1型糖尿病模型小鼠体内，可使糖尿病小鼠的血糖降至正常。结论：利用该方法得到的胰岛细胞活力和纯度均较高，体外培养后细胞功能正常，有望成为一种实用的降糖药研究的细胞模型。     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞

目的：作者分别采用酶消化法和组织块法培养人牙周膜细胞，并对这两种方法进行比较。方法：倒置相差显微镜连续观察体外培养的人牙周膜细胞原代和传代生长情况，从形态学、免疫组化及细胞增殖方面对比两种方法培养细胞的异同。结果：两种方法培养的细胞形态大致相同，来源一致，增殖和生长曲线大体一致。组织块法培养的细胞同源性好，但初代培养时间长；酶消化法培养的细胞一次可获得的细胞量大，但容量污染，且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞，需多次传代才能去除。结论：组织块法培养HPLFs适用于细胞纯度要求较高的实验，而酶消化法培养HPLFs适用于短期内获得大量细胞的实验。     

17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖影响的体外研究

目的：观察不同浓度17β-雌二醇对体外培养人牙髓细胞增殖的影响。方法选取年轻恒牙,采用组织块酶消化法获取人牙髓细胞并进行原代培养。取第4代对数生长期人牙髓细胞SABC法进行波形蛋白和角蛋白免疫组化染色鉴定细胞来源。将处于对数生长期的第4代人牙髓细胞随机分为5个实验组、1个对照组和1个空白对照组,96孔培养板每组选6个孔。实验组：在有细胞孔内分别加入含2％活性碳吸附胎牛血清的无酚红高糖DMEM培养液配置的终末浓度为10－5、10－6、10－7、10－8、10－9 mol／L的17β-雌二醇。对照组：在有细胞孔内仅加入培养液。空白对照组：在无细胞孔内仅加入培养液。分别于培养48 h和72 h时用MTT比色法检测17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖的影响。采用流式细胞术检测各浓度组17β-雌二醇对人牙髓细胞的细胞周期的影响。结果与对照组比较,在一定浓度范围内17β-雌二醇能促进人牙髓细胞的增殖和细胞周期进程,以10－8 mol／L的17β-雌二醇作用最为明显（ P＜0．05）。结论17β-雌二醇对人牙髓细胞细胞增殖有一定的诱导作用。     

葡萄糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

目的：目前小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESC）常规应用高浓度葡萄糖（25mmol／L）培养基培养,但是在应用干细胞向糖尿病胰岛beta细胞分化的研究中发现,慢性高糖培养可促进干细胞的凋亡、降低细胞分化的效率及分化后胰岛beta细胞对葡萄糖的反应性,因此本研究拟选择合适的较低浓度的葡萄糖以优化胚胎干细胞的培养基、提高胚胎干细胞的生长、分化效率。方法：mESC传代4或12h后,将传统的25mmol／L葡萄糖培养基分别换为5、10、15、25mmol／L葡萄糖培养基培养,均用碱性磷酸酶（AP）染色计数细胞集落形成情况、台盼兰染色测定细胞数目,MTT法测定细胞活力及用4’,6-联脒-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色检测细胞凋亡情况。结果：mESC传代4h后即调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成明显减少。（2）各葡萄糖浓度组与25mmol／L组相比,mESC增殖及细胞活力均受到不同程度明显影响。mESC传代12h后调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成无明显变化,且AP染色呈强阳性。（2）15mmol／L葡萄糖组对mESC增殖及细胞活力均无明显影响。（3）15mmol／L葡萄糖组与25mmol／L葡萄糖组细胞核形态正常,均未见明显凋亡。结论：ESC传代12h后将培养基中传统的高糖（25mmol／L）降低为15mmol／L,不影响mESC细胞活力及多能分化潜能和未分化状态。     

棕榈酸对小鼠胰岛和INS-1E细胞作用的研究

目的:探讨高脂对INS-1E细胞和小鼠胰岛的慢性作用.方法:雌性NMRI小鼠6～10周龄,苯巴比妥腹腔麻醉,常规开腹,取小鼠胰腺组织,应用胶原酶技术消化胰腺分离胰岛.传代培养的INS-1E细胞和分离的小鼠胰岛分别在含与不含棕榈酸的RPMI1640中培养72 h,然后在含3.3、16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中培养60min,留取上清液行胰岛素测定.INS-1E细胞在含不同浓度的棕榈酸的RPMI1640中培养72 h,提取其总RNA,合成相应的cDNA,再行RT-PCR检测胰十二指肠同源异形盒1(Pdx1),胰岛素1、胰岛素2和葡萄糖转运子2的基因表达.结果:高脂培养后INS-1E细胞和小鼠胰岛的基础胰岛素分泌增加,糖刺激的胰岛素分泌减少,INS-1E细胞的胰岛素1,胰岛素2和葡萄糖转运子2的mRNA水平下降.结论:高脂显示了对胰岛B细胞的慢性毒性作用.     

冻存人胎胰岛细胞移植治疗胰岛素依赖型糖尿病

我们采用人工“三步”降温法，通过冻存入胎胰岛细胞移植，对８例胰岛素依赖型糖尿病患者进行了治疗。结果显效４例，有效３例，无效１例。移植后胰岛素用量、血糟、尿糖明显降低，餐后２小时胰岛素、Ｃ肽、体重明显增加，与移植前比较，统计学上有显著意义。各种慢性并发症有不同程度的好转或治愈。结果表明，冻存入胎胰岛细胞移植，有１次获得足量胰岛细胞的优点，并解决了胰岛细胞的保存问题。在人胎胰岛细胞移植前的处理过程中，除去了过路白细胞和胰腺外分泌细胞，从而降低了免疫原性，使有效细胞得到优化和浓缩，一定程度上降低了排斥反应，提高了胰岛移植的成功率。