汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化

目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。     

人DRR1真核表达载体和稳定转染HEK293细胞株的建立及鉴定

目的:构建人DRR1基因的真核表达载体,通过转染HEK293细胞建立稳定的DRR1表达细胞株.方法:通过改造质粒pIRES,在其MCS1和MCS2中分别引入串联亲和纯化标签和绿色荧光蛋白基因,形成一个新的表达质粒pFSIG.将PCR扩增的DRRl1基因插入pFSIG中进行酶切和测序验证.用重组质粒pFSIG-DRR1转染HEK293细胞,通过G418和绿色荧光检测筛选DRR1稳定表达细胞株.通过Westernblot鉴定FS-DRR1蛋白的表达.结果:酶切、PCR和测序证实成功构建了pFSIG-DRR1表达质粒;建立了稳定转染的HEK293细胞系,Western blot检测证明重组DRR1在该细胞系中成功表达.结论:融合有串联亲和纯化标签的DRR1真核表达载体的构建和稳定表达细胞HEK293株的建立为在生理条件下研究DRR1的相互作用蛋白奠定了基础.     

人组蛋白H3真核表达载体的构建及功能初步检测

目的构建带myc标签的人组蛋白H3基因真核表达载体,获得Myc-H3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法采用PCR技术从乳腺文库中扩增人H3基因编码序列,将其正确插入pXJ-40-myc载体,重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western blot法检测融合蛋白表达,通过免疫共沉淀技术检测融合蛋白与已知结合蛋白组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1)和组蛋白甲基转移酶(EZH2)的相互作用。结果构建得到组蛋白H3基因的真核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;经Western blot法检测,融合蛋白成功表达;免疫共沉淀检测证实Myc-H3融合蛋白可以和已知相互作用蛋白LSD1及EZH2相互作用。结论成功构建组蛋白H3真核表达载体,该融合蛋白正确表达。     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

鸡Ii与B-L基因表达产物的细胞定位与结合活性特征

目的:研究鸡Ii与B-L基因表达产物在细胞内定位和互相结合的活性特征。方法:将克隆的Ii、B-LA和B-LB基因片段分别插入原核或真核表达质粒;然后分别单独转染或共转染工程菌Rosetta(DE3)或293T细胞。所有重组菌经鉴定后进行诱导表达后再复性。单一表达产物用免疫印迹检测它们的抗原性,共转染表达的产物用pull-down法和(SDS-)PAGE观察其互相结合特征。结果:成功构建了6个原核和真核表达重组质粒。在真核细胞中Ii、B-LA和B-LB基因表达产物定位于细胞浆膜,而原核表达产物经复性后和亲和层析纯化,获得单一蛋白分子。其次,原核表达的Ii与B-LA和B-LB复性蛋白能够诱导产生鼠源抗体,这些抗体特异性结合真核表达产物,表明它们保持相同的免疫原性。最后,用pull-down从共转染的工程菌表达并复性的蛋白分子中分别获得纯化的Ii/B-LA和Ii/B-LB复合物,它们经SDS处理后分别被解离成单体。结论:鸡Ii和B-L基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性,而原核共表达的Ii和B-L蛋白分子复性后可以互相结合。本研究的结果为进一步研究Ii与B分子关系提供了方法。     

Cyclin G2与LDHA相互作用的鉴定分析

目的分析细胞周期素G2(cyclin G2)与乳酸脱氢酶A(LDHA)之间的相互作用及其意义。方法将LDHA全长cDNA片段分别克隆到pGEX-5X-1和p3×FLAG-CMV-14载体上,构建pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMV-LDHA真核重组蛋白表达载体,诱导表达并纯化GST-LDHA融合蛋白,通过GST pull-down及western blot技术分析cyclin G2与LDHA的相互作用。分别转染p3×FLAG-CMV-LDHA、pEGFP-FALGCCNG2质粒到HEK293细胞使其表达,利用带有抗FLAG蛋白标签抗体的免疫沉淀凝胶进行Co-IP实验,进一步验证cyclin G2与LDHA的相互作用。结果成功构建了pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMVLDHA真核重组蛋白表达载体。GST pull-down实验证实了cyclin G2与LDHA在细胞外的相互作用。Co-IP实验证实了cyclin G2和LDHA在细胞内的相互作用。结论 cyclin G2与LDHA在细胞内和细胞外能发生相互作用,为研究cyclin G2生物学功能奠定实验基础。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

α-1,2岩藻糖基转移酶基因293C＞T和658C＞T突变真核细胞稳定表达的研究

目的 建立α-1,2岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-fucosyltransferase gene,FUT1)293C＞T和658C＞T突变真核表达细胞,阐明FUT1突变引起H抗原减弱的机制.方法 抽提类孟买型先证者基因组DNA扩增FUT1全长编码序列,扩增片段与真核表达载体pcDNA3.1连接构建重组表达质粒.采用脂质转染技术将重组质粒转染COS7细胞并进行稳定表达筛选.采用实时荧光定量PCR检测mRNA表达量,应用HPLC检测酶活性,采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western印迹技术鉴定蛋白.结果 构建了pcDNA3.1-FUT1野生型、pcDNA3.1- FUT1 293C＞T、pcDNA3.1-FUT1 658C＞T真核表达重组质粒,转染后通过G418筛选获得了稳定表达FUT1的COS7细胞.以野生型重组体转染细胞中FUT1 mRNA量作为对照,293C＞T和658C＞T重组体转染细胞FUT1 mRNA量分别为野生型的97.10％和104.74％.经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测显示细胞表达相对分子质量约46000大小的目的蛋白片段,pcDNA3.1-FUT1野生型重组体转染细胞表达蛋白可催化相应的酶促反应,而pcDNA3.1-FUT1 293C＞T、pcDNA3.1- FUT1 658C＞T转染细胞蛋白完全失去酶活性.结论 体外实验提示293C＞T和658C＞T突变并不影响FUT1 mRNA转录和蛋白生成,但表达蛋白的酶活性明显下降,从而导致H抗原生成减弱.     

Trim22缺失突变体真核表达载体的构建

目的构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础。方法以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞中表达。结论成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

摘要 背景：人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。 目的：构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。 方法：以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其 C端 936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。 结果与结论：经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。 关键词：人端粒酶反转录酶C端;重组质粒;人胚肾细胞293T;蛋白表达;免疫印迹 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.018     

人白介素17F真核蛋白表达及促炎症作用的研究

利用真核表达载体pCEP4,在人肾上皮293T细胞中表达hIL-17F/mFc融合蛋白并初步研究IL-17F生物学特性。实验应用RT-PCR法克隆hIL-17F CDS段基因序列。将测序正确的hIL-17F序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/hIL-17F真核表达载体。转染人肾上皮293T细胞后,筛选阳性表达细胞株。RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定hIL-17F分子的mRNA和蛋白表达。体外实验验证其促炎症作用。结果表明,构建的pCEP4/hIL-17F重组表达载体,能在293T细胞中稳定表达。获得的hIL-17F重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17RC受体。体外刺激ECV304细胞,能显著促进IL-2等炎症因子的分泌。稳定表达hIL-17F重组蛋白的293T细胞系的建立,为进一步研究hIL-17F的生物学功能奠定了良好的基础。     

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。     

应用Profinity eXact标签在真核表达系统中纯化EGFP蛋白

目的研究Profinity eXact标签在真核蛋白表达系统中的纯化效果。方法通过PCR扩增Profinity eXact标签,构建中间载体pUC18ETagEGFP,构建Profinity eXact标签绿色荧光蛋白真核表达载体FUETagEGFP,采用DNA-磷酸钙方法转染293FT细胞,收集过量表达Profinity eXact标签绿色荧光蛋白的细胞,随后提取蛋白进行纯化,采用荧光检测EGFP蛋白结合、纯化效率,最后利用SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度。结果经PCR扩增、酶切和测序,Profinity eXact标签、中间载体pUC18ETagEGFP、Profinity eXact标签真核表达载体构建正确,经荧光显微镜镜下观察Profinity eXact标签真核表达载体转染293FT细胞效果良好,经荧光检测确定EGFP蛋白结合、纯化效率,经SDS-PAGE发现Profinity eXact标签在真核蛋白系统中纯化效果良好。结论 Profinity eXact标签在真核蛋白表达系统中能正常工作,并有较好的纯化效果。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

pcDNA3.1+-MBL 真核表达载体构建及其在不同哺乳动物细胞株中的表达

目的　比较人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因在不同哺乳细胞株中的表达效率。方法　应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM MBL中扩增目的基因片段 ,将其克隆至pcDNA3.1 表达载体 ,经酶切及测序鉴定后 ,以电穿孔法转染CHO、HEPG2和HEK2 93细胞 ,以RT PCR、ELISA分析其在 3株细胞中的表达情况。结果　从pGEM MBL中扩增得到约 75 0bp的MBLDNA片段 ,构建成重组表达载体pcDNA3.1 MBL ,经酶切出现 75 0bp片段 ,测序鉴定与预期的完全一致。将其转染进细胞后 ,经G4 18选择转染子并克隆化培养 ,RT PCR和ELISA分析显示 ,在CHO和HEK2 93细胞中及培养上清液中分别有较高的MBLmRNA和蛋白表达 ,而HEPG2细胞表达较低。结论　人MBL在CHO和HEK2 93细胞中的表达效率较高 ,为今后在哺乳动物细胞中高效表达人MBL积累了经验     

人TCA-12-2/TCB-7.1真核双表达载体的构建与表达

目的：将T细胞抗原受体基因TCA-12-2和TCB-7.1共同构建在真核表达载体pDC315，用于哺乳动物细胞293转染研究。方法： 将分离得到的淋巴细胞总RNA反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到TCA-12-2基因；以实验室保存含TCB-7.1基因的质粒为模板，扩增得到TCB-7.1基因。随后酶切，连入载体pIRES2-AcGFP1，通过亚克隆连入载体pDC315，得到重组质粒pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1。重组体质粒经酶切鉴定后，并对插入的TCA-12-2和TCB-7.1基因片段进行测序，将鉴定好的阳性重组质粒用脂质体介导转染293细胞，并通过RT-PCR和流式细胞仪检测TCA-12-2和TCB-7.1基因的表达情况。结果： TCA-12-2和TCB-7.1可以同时构建在载体pDC315上，RT-PCR和流式细胞仪检测发现TCA-12-2和TCB-7.1基因可以成功在293细胞上表达。结论：成功构建了含TCA-12-2和TCB-7.1基因的双表达载体。     

骨关节炎疾病中白细胞介素17协同肿瘤坏死因子α调节诱导型一氧化氮合酶的表达

背景：白细胞介素17是由新近被证实的CD4+辅助性T细胞亚型Thl7细胞产生的促炎性细胞因子,表达在T细胞上,其受体表达在大多数细胞和组织上。 目的：探讨人白细胞介素17 通过与其受体(白细胞介素17受体A,白细胞介素17受体C)结合,在与肿瘤坏死因子α的共同作用下对滑膜组织诱导型一氧化氮合酶启动子的表达和对一氧化氮合成的影响。 方法：提取人膝关节关节软骨及滑膜组织中mRNA,同时构建白细胞介素17受体A和白细胞介素17受体C的干扰RNA表达质粒,转染至293T,在G418筛选压力下建立白细胞介素17受体表达缺陷型细胞模型。将含有诱导型一氧化氮合酶启动子的重组真核质粒分别转染至野生型293T和白细胞介素17受体A表达缺陷型293T细胞,在外源性白细胞介素17和肿瘤坏死因子α的共同诱导下,通过检测荧光素酶含量和一氧化氮的浓度来观察诱导型一氧化氮合酶启动子的表达和诱导型一氧化氮合酶的活性。 结果与结论：①成功获得含有人诱导型一氧化氮合酶启动子全长cDNA的真核表达质粒pGL3-iNOSp-luciferase。② 建立了人白细胞介素17受体A表达缺陷型细胞模型。③在白细胞介素17受体A表达缺陷型细胞中,诱导型一氧化氮合酶启动子和诱导型一氧化氮合酶活性显著降低。④成功构建了人白细胞介素17受体C的特异性shRNA真核表达载体shRNA-IL-17RC。表明白细胞介素17通过其受体白细胞介素17受体A与诱导型一氧化氮合酶启动子的结合,显著促进了细胞诱导型一氧化氮合酶基因的表达和一氧化氮产量。     

真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

人黑色素瘤抗原MAGE—3基因的克隆与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异抗原MAGE-3基因,以制备肿瘤DNA疫苗。方法 用RT-PCR方法制备MAGE-3基因,以哺乳细胞高效表达质粒pCI-neo为载体,构建重组DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3基因的表达。结果 正确构建了MAGE-3/pCI-neo重组质粒,并且在转化细胞中检测出了MAGE-3的表达。结论 成功地构建了重组MAGE-3/pCI-neo肿瘤核酸疫苗,可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察。