TCR Vβ17．1基因转染外周血单个核细胞后表达及抗癌作用

目的研究TCR Vβ7．1基因在恢复肝癌病人细胞毒性T细胞(CTL)功能方面的作用。方法以RT-PCR方法扩增TCR Vβ7．1基因并构建Vβ7．1-pLXSN表达载体。重组体以脂质体转染外周血单个核细胞(PBLs)，流式细胞仪检测转染效率，DNA Ladder实验和透射电镜观察转染后T细胞诱导肿瘤细胞凋亡情况。结果TCR Vβ7．1基因转染PBLs后可有效表达并诱导肿瘤细胞凋亡。结论该方法为T细胞介导的肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

TCR Vβ7.1基因转染外周血单个核细胞后表达及抗癌作用

目的研究TCRVβ7.1基因在恢复肝癌病人细胞毒性T细胞(CTL)功能方面的作用。方法以RTPCR方法扩增TCRVβ7.1基因并构建Vβ7.1-pLXSN表达载体。重组体以脂质体转染外周血单个核细胞(PBLs),流式细胞仪检测转染效率,DNALadder实验和透射电镜观察转染后T细胞诱导肿瘤细胞凋亡情况。结果TCRVβ7.1基因转染PBLs后可有效表达并诱导肿瘤细胞凋亡。结论该方法为T细胞介导的肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

PADRE/MUC4 重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究

目的:观察PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体外特异性杀伤作用.方法:pAd-CMV-PADRE/MUC4转染HLA-A2健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的未成熟DC,TNF-α诱导成熟后与自体PBMC混合培养刺激3周,Cr51和Elispot实验检测CTL体外杀伤活性.结果:Cr51和Elispot检测结果显示PADRE/MUC4转染DC可以诱导产生特异性CTL,而pAd-CMV-GFP组和空白对照组不能产生有效特异性CTL.结论:腺病毒载体介导多表位嵌合基因(PADRE/MUC4)转染未成熟DC,在体外可以诱导产生特异性CTL,对表达MUC4肿瘤细胞具有杀伤效应.     

KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞杀伤活性和TCR Vβ T细胞增殖的研究

【摘　要】　目的　了解急性髓系白血病KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞的特异性细胞毒作用和T细胞受体(TCR) Vβ谱系表达和克隆性情况。方法　分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照，建立TCR Vβ谱基因扫描技术，并用其检测5例健康个体T细胞克隆表型。采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养方法，以照射后的KG1a细胞作为刺激原体外诱导外周血单个核细胞增殖，应用LDH释放法检测不同效靶比时诱导前后T细胞杀伤KG1a细胞的活性，同时利用基因扫描技术分析诱导后TCR Vβ亚家族的克隆性增殖特点。结果　基因扫描显示5例健康人全部TCR Vβ谱型均呈高斯(钟型)分布，各亚家族表达频率接近，但呈现不同的多态性和长度分布。KG1a细胞可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞，并具有特异性识别和杀伤KG1a细胞的功能。结论　KG1a细胞在体外可诱导T细胞呈克隆性增殖，此优势增殖的克隆性T细胞具有特异性细胞毒作用，对KG1a细胞具有选择性杀伤作用。     

超抗原肠毒素B对T淋巴细胞趋化因子受体表达的影响及意义

目的 观察超抗原肠毒素B(SEB)活化的人外周血T淋巴细胞趋化因子受体变化规律及意义.方法 应用SEB处理人外周血T淋巴细胞,RT-PCR和流式细胞仪检测T淋巴细胞趋化因子受体CCR2、CCR3、CCR5的转录、表达水平;TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞,流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖反应.结果 与空白对照组相比,SEB 刺激PBMC 2 d 后,倒置显微镜就可以观察到T细胞开始增殖;而TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞,流式细胞仪检测T细胞增殖时却需要在细胞培养第5天后才检测到明显的细胞增殖,T细胞增殖发生在特异的TCR Vβ3、TCR Vβ17、TCR Vβ14亚族.SEB刺激的T细胞早期(8 h)出现CCR2的下调表达,CCR3没有显著改变;但CCR5的表达在各SEB浓度组都出现显著上调表达(P<0.01或P<0.05).结论 CCR5的上调表达可以作为超抗原活化T细胞的早期标志.     

六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因导入增强外周血单个核细胞抗药性

目的研究六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因导人后人外周血单个核细胞（PBMC）对烷化剂抗药性的改变。方法利用脂质体法将含人MGMT基因的真核表达载体导人体外培养的外周血单个核细胞，实时PCR及Western blot检测目的基因mRNA及蛋白水平的表达。四氮唑蓝法（MTT）检测细胞对硝卡芥抗药性的改变。结果转染目的基因组在mRNA及蛋白水平与转空载体及对照相比均为高表达。MTT法结果显示转目的基因组对硝卡芥的IC50是转空载体组及对照组的两倍。结论MGMT基因导人能够增强外周血单个核细胞对烷化剂的抗性从而起到保护作用。     

体外利用MGc80-3胃癌细胞诱导肿瘤杀伤细胞的实验研究

以健康人外周血单个核细胞作为肿瘤杀伤细胞的前体细胞，ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞作为刺激细胞，在体外进行同种异体淋巴细胞和肿瘤细胞混合培养之后，单独加入重组白介素 ２和同时加入重组白介素 ２、抗ＣＤ３单克隆抗体，分别诱导出Ｌ 肿瘤杀伤细胞和ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞．用噻唑蓝比色法在体外检测其对ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞的杀伤活性，并与淋巴因子 激活杀伤细胞、ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞相比较结果显示，ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞的杀伤活性最高．在倒置显微镜下及透射电镜下观察ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞对ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞的杀伤过程，发现ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞首先接触、粘附靶细胞，以细胞坏死和细胞凋谢的方式杀伤肿瘤细胞     

肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的 探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响.方法 以肝癌特异性T细胞受体V β7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达.肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群:以Annexin V-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能.结果 TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.与PBMC对照组相比.TCRVβ37.1转染组CD45RO表达显著上升.以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞.分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升.结论 肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化.TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能.     

超抗原SEB对T淋巴细胞趋化因子受体表达的影响及意义

[摘要] 目的 观察超抗原肠毒素B（SEB）活化的人外周血T淋巴细胞趋化因子受体变化规律及意义。方法 应用SEB处理人外周血T淋巴细胞、RT-PCR和流式细胞仪检测T淋巴细胞趋化因子受体CCR2、CCR3、CCR5的转录、表达水平;TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖反应。结果与空白对照组相比,SEB 刺激PBMC 2 d 后,倒置显微镜就可以观察到T细胞开始增殖,而TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞流式细胞仪检测T细胞增殖时却需要在细胞培养第5天后才检测到明显的细胞增殖,T细胞增殖发生在特异的TCR Vβ3、TCR Vβ17、TCRVβ14亚族。SEB刺激的T细胞早期（8 h）出现CCR2的下调表达,CCR3没有显著改变;但CCR5的表达在各SEB浓度组都出现显著上调表达（P ＜0.01或P ＜0.05）。结论CCR5的上调表达可以作为超抗原活化T细胞的早期标志。     

γ-干扰素基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的生物学特性

目的 研究重组腺病毒介导的小鼠γ -干扰素 (mIFN -γ)基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法 按重复感染度 (MOI)=1∶100转染G422细胞 (G422/mIFN -γ细胞 ) ,检测转染后不同时间mIFN -γ的表达 ;MTT法检测基因转染细胞的体外增殖活性 ,设立转染LacZ基因的病毒对照细胞和野生G422对照细胞。观察基因转染细胞接种于小鼠皮下后的成瘤性和小鼠存活期 ,LDH法检测荷瘤小鼠脾自然杀伤细胞 (NK)、细胞毒T淋巴细胞 (CTL)及腹腔巨噬细胞 (MΦ)杀伤活性。结果 mIFN -γ基因转染后2h即可在培养上清中检测到mIFN -γ表达。腺病毒mIFN -γ基因转染对体外G422细胞增殖能力无影响,而接种体内后肿瘤生长缓慢 ,小鼠存活期延长。G422/mIFN -γ细胞接种组小鼠脾NK、CTL及腹腔MΦ杀伤活性显著增强 (P<0.05)。结论 重组腺病毒可介导IFN -γ基因转染G422细胞并高效表达。IFN -γ基因转染的G422细胞具有瘤苗的作用 ,能诱导抗肿瘤免疫反应。     

白细胞介素15对人外周血单个核细胞抗肿瘤活性和T细胞受体谱型的影响

目的:探讨重组人白细胞介素15(rhIL-15)对人外周血单个核细胞(PBMC)抗肿瘤效应及T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)的影响.方法:应用LDH释放法检测rhIL-15作用前后PBMC对人急性髓系白血病细胞KGla的杀伤活性.分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照.建立TCB CDR3基因扫描技术,并用其检测rhIL-15作用前后5名健康个体T细胞克隆表型.结果:rhIL-15作用后PBMC对KG1a细胞的杀伤活性较rhIL-15作用前明显增强(P<0.05).基因扫描显示5名健康个体TCR CDR3谱型均呈高斯分布,各家族CDR3表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.rhIL-15作用前后5名健康个体T细胞克隆表型无明显变化.结论:rhIL-15能显著提高PBMCs的抗肿瘤效应,并不改变T细胞的克隆表型.     

人β-防御素4基因在HEK293细胞中的转染表达

目的人β-防御素4(humanβ-defensin 4,HBD 4)对多种病原菌有杀伤作用。HBD4的自然表达水平极低,体外获得难度较大且价格昂贵。利用基因工程技术生产重组的HBD4成为研究的焦点。文中旨在构建HBD4真核表达载体,探讨真核细胞表达HBD4的可行性。方法用PCR法从已构建的重组克隆载体pMD18-T/HBD4中扩增出HBD4全长编码基因,克隆入真核表达载体pEGFP-N2,构建pEGFP-N2/HBD4重组真核表达载体;通过脂质体转染法将pEGFP-N2/HBD4导入HEK293细胞,采用RT-PCR、荧光显微镜、Western blot检测HBD4的mRNA和蛋白表达情况,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果构建的重组真核表达载体pEGFP-N2/HBD4,经酶切鉴定、测序,证实插入的序列与Genebank中的HBD4基因序列完全相同。将pEGFP-N2/HBD4转染HEK293细胞,在转染细胞检测到HBD4mRNA表达。荧光显微镜下可在细胞膜及细胞质中观察到绿色荧光。Western blot分析显示:在pEGFP-N2/HBD4转染的HEK293细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby—Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对铜绿假单胞菌具有较强的杀伤作用。结论成功构建了HBD4基因的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达出具有抗菌活性的HBD4多肽。     

APL细胞诱导脐血TCR Vα和Vβ亚家族T细胞增殖和细胞毒性研究

目的 了解急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞体外诱导脐血T细胞的TCR Vα和Vβ亚家族克隆性增殖及针对APL细胞特异性杀伤情况.方法 采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养(MLTC)方法,利用APL细胞体外诱导脐血T细胞增殖,用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCR Vα亚家族基因和24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解各亚家族的T细胞克隆性增殖特点,并应用LDH法分析诱导增殖的T细胞针对APL细胞特异性杀伤作用.结果 经APL细胞刺激后增殖的脐血T细胞表达部分Vα和Vβ谱系基因,并在Vα10、Vβ5和Vβ15出现有克隆增殖趋势,诱导后T细胞对APL细胞的杀伤性均高于未诱导组的T细胞.结论 APL细胞体外诱导脐血T细胞出现抗原相关的TCR Vα和Vβ亚家族优势利用和克隆性增殖;诱导后的T细胞对APL细胞具有特异性细胞毒性作用.     

转基因马铃薯中人白介素-12的生物学活性

目的 检测转基因马铃薯体系中表达的人白介素-12(human interleukin 12,hIL-12)的肿瘤杀伤活性.方法 通过ELISA法检测转基因马铃薯中hIL-12刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的量以反映生物学活性,并观察hIL-12单克隆抗体对此生物活性的阻断效应;MTT法检测经转基因马铃薯中hIL-12作用的PBMC对NK敏感肿瘤细胞K562的杀伤作用,肿瘤细胞凋亡以Annexin V/PI双染后激光共聚焦显微镜观察.结果 转基因马铃薯叶和块茎中表达的hIL-12与重组人白介素-12(rhIL-12)标准品在25～400 pg/ml间均能诱生IFN-γ,其中转基因马铃薯叶和块茎中hIL-12刺激PBMC产生IFN-γ的量分别为(163.34±22.17)～(12 107.10±3 996.51)pg/ml和(224.20±25.76)～(11 196.30±4 067.48)pg/ml,与野生对照组均有统计学差异(P<0.01),而hIL-12单克隆抗体能完全阻断此诱生IFN-γ效应.同时200 pg/ml转基因马铃薯叶、块茎中提取的hIL-12对人红白血病细胞K562的杀伤率分别为(28.4±8.7)%、(32.3±6.9)%,而与野生对照组(10.3±4.9)%的杀伤率相比,有统计学差异(P<0.05).激光共聚焦显微镜观察到经转基因马铃薯表达hIL-12作用的K562细胞出现早、中、晚各期的凋亡特征.结论 转基因马铃薯表达的hIL-12具有诱导PBMC产生IFN-γ及杀伤肿瘤细胞K562的生物学活性.     

mdr1基因重组腺病毒转染小鼠单个核细胞对其胞内结构的影响

目的 用表达EGFP和mdr1基因重组腺病毒转染原代培养的小鼠单个核细胞,研究该重组腺病毒在其细胞表达的安全性.方法 将重组腺病毒Ad-EGFP-mdr1转染原代培养的Babl/c小鼠单个核细胞,以EGFP做报告基因用荧光倒置显微镜观察其在细胞内的表达.用透射电镜观察其在胞内分布.结果 荧光显微镜下可观察到转染成功的原代培养小鼠单个核细胞发绿色荧光.电镜检查其胞内有大量病毒颗粒存在,细胞超微结构正常.结论 用EGFP检测转染重组腺病毒Ad-EGFP-mdr1的单个核细胞方法简单,其线粒体、内质网、细胞核等超微结构无病理性改变.实验证明转染是安全有效的.为进一步研究转染Ad-EGFP-mdr1单个核细胞回输的骨髓保护作用的安全性奠定基础.     

超声微泡介导沉默T 淋巴细胞Itch 基因对胃癌MFC 细胞免疫杀伤作用的实验研究

目的 利用超声介导微泡破裂技术（UTMD）沉默T 淋巴细胞Itch 基因表达,观察转染T 细胞 对胃癌MFC 细胞的免疫杀伤效率。方法 免疫磁珠分离T 淋巴细胞,构建靶向Itch 基因的shRNA 表达质 粒,超声微泡介导转染48 h 后,流式细胞仪分析T 细胞转染成功率,Western blot 测定T 细胞Itch 蛋白表达。转 染24 h 后,流式细胞仪检测T 淋巴细胞活化早期标志CD69 表达。转染72 h 后,观察对比单纯T 淋巴细胞、 阴性对照T 淋巴细胞及转染T 淋巴细胞与小鼠胃癌MFC 细胞共培养时肿瘤杀伤率。结果 利用UTMD 技 术介导shRNA 转染效率达到51.9%,Itch 蛋白表达能被有效抑制。转染24 h 后,转染组T 淋巴细胞早期活化 标志CD69 表达较其他组更高。转染72 h 后,与阴性对照组和空白组相比,在不同的效靶比水平（10 ∶ 1、 20 ∶ 1、40 ∶ 1）,转染T 淋巴细胞杀瘤活性均增强。结论 利用UTMD 技术介导shRNA 转染能有效沉默 Itch 基因表达,促进T 淋巴细胞免疫活性,增强T 淋巴细胞对胃癌MFC 细胞的免疫杀伤效率。     

抗原致敏DC联合LAK细胞对肺腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察抗原致敏树突状细胞（DC）联合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞对肺腺癌细胞的杀伤作用。方法：采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC）,常规诱导出DC、LAK细胞。倒置显微镜观察细胞的形态和增殖情况;应用流式细胞仪（FCM）测定细胞表型上变化鉴定这两种细胞。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化;利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测法把DC-LAK细胞和DC-LAK-A549细胞作为效应细胞,肺腺癌A549细胞作为靶细胞,进行杀伤试验。结果：①体外诱导单个核细胞培养出DC和LAK细胞。②共培养后DC-LAK细胞的免疫表型表达增加。抗原致敏DC联合LAK细胞（DC-A549-LAK）组的免疫表型表达与对照组相比更有显著性意义。③共培养细胞在增殖倍率上有显著意义。④MTT显示共培养后的LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。结论：从外周血单个核细胞中诱导出具有典型形态和免疫表型的DC和LAK细胞。DC和LAK细胞共培养细胞,增殖活性、免疫表型、杀伤活性方面高于单纯培养的LAK细胞。抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。     

CpG-ODN活化的外周血单个核细胞体外对肿瘤细胞杀伤效应的研究

目的探讨CpGODN体外活化的外周血单个核细胞（PBMC）后对肿瘤细胞的杀伤效应。方法CpG—ODN体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC），将活化的PBMC与肿瘤细胞按50：1的比例共孵育72h后，以MTT和酶学检测活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。结果CpC—ODN诱导活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用增强，而对正常肝细胞则无明显的杀伤作用。结论CpG—ODN可诱发机体免疫效应，提高对肿瘤细胞的杀伤作用。