补肾活血中药血清对高糖状态下纯化培养的视网膜神经节细胞活力的影响

目的 探讨补肾活血中药血清对体外高糖状态下纯化培养的视网膜神经节细胞活力的影响。     

Müller细胞在高糖状态下的变化

糖尿病性视网膜病变(diabetic retionopathy,DR)是糖尿病严重的并发症之一,也是常见的致盲性眼病。近年来随着DR的研究进展,视网膜神经细胞的损伤也倍受关注。本文就视网膜高糖状态下Müller细胞的变化等内容进行综述。     

补肾活血中药血清对高糖条件下纯化培养的视网膜神经节细胞Glu释放量的影响

目的探讨稳定高糖及糖波动条件对体外纯化培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)谷氨酸(glutamate,Glu)释放量的影响,以及补肾活血中药的干预作用。方法采用抗体联合两步纯化法培养新生Sprague-Dawley(SD)大鼠RGCs,将其分别置于模拟正常条件、稳定高糖条件及糖波动条件下进行培养,并以补肾活血中药复方含药血清进行干预。实验分为正常对照组、正常中药干预组,稳定高糖组、稳定高糖中药干预组、糖波动组、糖波动中药干预组;分别在试验干预24、48、72h后,用全自动氨基酸分析仪测定各组细胞外液中Glu的含量(mg/L),采用SPSS13.0软件对所得数据进行统计学分析。结果糖波动组24h时RGCs的Glu释放量[(256.33±25.73)mg/L]较同期正常对照组[(134.22±9.14)mg/L]及稳定高糖组[(141.17±22.13)mg/L]均明显增加(P0.05)。正常中药干预组的Glu释放量在24h[(124.50±10.30)mg/L]及72h[(30.17±2.97)mg/L]时段均较正常对照组降低(P0.05);稳定高糖中药干预组24h[(127.50±16.94)mg/L]、48h[(26.17±3.99)mg/L]及72h[(27.67±3.49)mg/L]时段的Glu释放量均较稳定高糖组降低(P0.05);糖波动中药干预组RGCs的Glu释放量在24h[(228.33±18.41)mg/L]、72h[(28.00±2.41)mg/L]均较糖波动组降低(P0.05)。结论糖波动条件能明显增加RGCs的Glu释放量,导致大量Glu在细胞外聚积,细胞外高浓度Glu聚积最终引发RGCs神经兴奋性毒性,加剧细胞损害;补肾活血中药能在一定程度降低稳定高糖及糖波动条件下RGCs的Glu释放量,减轻Glu神经兴奋性毒性作用对RGCs的损伤,这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DRP)的药物干预途径之一。     

人参皂苷提取物对大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的研究人参皂苷对体外纯化培养大鼠视网膜Müller细胞的影响,为人参治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的物质基础研究筛选合适的浓度。方法用不同浓度的人参皂苷提取物及人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品分别干预体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞48 h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果测得人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品的IC50分别为0.618,0.489,0.653,0.553 mg/ml,给药浓度为1 mg/ml时,测得最高细胞增殖抑制率分别为56.8%,71.0%,59.4%,68.0%。结论人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品对大鼠视网膜Müller细胞均有一定抑制作用,且具有剂量依赖性,所测IC50值为进一步研究人参皂苷提取物治疗DR作用机制的有效浓度提供依据。     

补肾活血法对Müller细胞谷氨酸摄取功能的影响

目的 探讨补肾活血中药含药血清对高糖条件下Müller细胞谷氨酸(Glutamate,Glu)摄取功能的影响.方法 以改良酶消化法体外培养大鼠Müller细胞;根据[3H]标记的D,L- Glu摄入量判断Müller细胞的Glu摄取功能.结果 在高糖条件下Müller细胞的Glu摄取功能一过性提高,随时间推移其对Glu的摄取功能又明显下降;中药含药血清对正常条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后24小时时段最为明显,对高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后48小时时段最为明显.结论 高糖条件所引起的Müller细胞糖酵解在短时间内旺盛可能是Müller细胞Glu摄取功能一过性提高的原因之一;Müller细胞对短期高糖条件可能有一定耐受性,持续的高糖最终会导致Müller细胞的损伤;中药含药血清可减轻高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的下降,这可能是补肾活血法防治糖尿病视网膜病变的干预途径之一.     

丹参脂溶性成分对AGEs条件下视网膜Müller细胞HIF-1及谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的:研究丹参脂溶性成分对体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞在糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)条件下乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的漏出量、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)及谷氨酰胺合成酶表达的影响。方法:以5μg/ml的丹参脂溶性成分及5μg/ml丹参酮IIA分别干预视网膜Müller细胞,以ELISA法分别测定在正常及高、低浓度AGEs(150μg/ml、75μg/ml)条件下LDH漏出量以及HIF-1、谷氨酰胺合成酶的表达情况。结果:在正常及AGEs条件下,各组Müller细胞LDH的漏出量48 h较24 h明显减少,72 h较48 h明显增多,丹参脂溶性成分及丹参酮IIA组LDH漏出量较空白对照组小;在AGEs条件下,空白对照组HIF-1表达量较正常条件下显著增高;谷氨酰胺合成酶的表达量显著低于正常条件。丹参酮IIA、丹参脂溶性成分组与空白对照组相比,均能显著抑制HIF-1表达,增加谷氨酰胺合成酶的表达。结论:各实验组Müller细胞活力均呈现先升高、后降低,在48 h时Müller细胞膜活力最高。因此选择48 h作为最佳干预时间。AGEs能明显提高大鼠视网膜Müller细胞HIF-1的表达,抑制谷氨酰胺合成酶的表达。丹参脂溶性成分及丹参酮IIA均能抑制AGEs条件下大鼠视网膜Müller细胞HIF-1的表达,增强谷氨酰胺合成酶的表达,从而降低血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的生成量以及谷氨酸(Glutamate,Glu)的浓度,研究结果为进一步探讨丹参脂溶性成分治疗糖尿病性视网膜病变作用机制提供了一定的实验依据。     

补肾活血中药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 探讨补肾活血中药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响。方法 以链脲佐菌素造成大鼠糖尿病模型。利用微机图像分析技术夺视网膜神经细胞胞体中Ｎｉｓｓｌ小体进行定量测定和分析。结果 中药治疗组的糖尿病大鼠视网膜神经节细胞胞体中Ｎｉｓｓｌ小体减少程度明显低于阴性对照组和阳性对照Ⅰ组。结论 补肾活血中药有减轻实验性糖尿病视网膜神经节细胞病理损害的作用。     

补肾活血方对卵巢早衰小鼠颗粒细胞TGF-β1、TGF-βRII、Smad2/3表达的影响

目的探索补肾活血方(紫石英、补骨脂、菟丝子等)对免疫性卵巢早衰(POF)小鼠卵泡壁颗粒细胞转化生长因子(TGF)-β1、TGF-βRII、Smad2/3蛋白表达的影响。方法 Balb/c雌性小鼠皮下多点注射小鼠透明带3建立免疫性POF模型,POF小鼠分成模型组,阳性组(戊酸雌二醇)和补肾活血方低、中、高剂量组。干预30 d后,卵巢组织作苏木精-伊红(HE)染色,免疫组化法与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测卵泡壁颗粒细胞和卵巢组织TGF-β1、TGF-βRII、Smad2/3的蛋白表达。结果与模型组相比,补肾活血方各剂量组、阳性组卵巢成熟卵泡数目明显增多,闭锁卵泡数目减少。卵泡壁颗粒细胞和卵巢组织TGF-β1、TGF-βRII、Smad2/3蛋白表达在补肾活血方各剂量组、阳性组中明显高于在模型组中(P0.05)。结论补肾活血方能通过上调颗粒细胞TGF-β1、TGF-βRII、Smad2/3的蛋白表达改善卵巢功能。     

体外培养视网膜细胞高糖损伤模型的研究进展

尽管体内实验更接近真实状态,但体内实验影响因素较多,受多种因素干扰.建立合理的体外培养视网膜细胞高糖损伤模型,对进一步深入研究糖尿病视网膜病变的病理特性、药物作用机制和功能重建具有重要的作用.本文拟对体外培养的视网膜血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜Müller细胞以及视网膜神经节细胞高糖损伤模型的建立进行综述.     

补肾活血中药复方对AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

目的:探讨补肾活血中药对体外糖基化终末产物(AGEs)条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法:体外纯化培养7天SD大鼠视网膜Müller细胞至P2代;中药血清药理学方法制备补肾活血中药含药血清;体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞置于AGEs状态下,以补肾活血中药含药血清干预,检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果:(1)低AGEs组较正常对照组LDH值有升高趋势,其差异无统计学意义(P0.05);高AGEs组较正常对照组LDH值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。(2)正常中药干预组与正常对照组LDH值比较,其差异无统计学意义(P0.05)。(3)AGEs中药干预组较AGEs组LDH值明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:AGEs条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞细胞膜稳定性下降,通透性增加,细胞活力降低,补肾活血中药含药血清可提高AGES条件下视网膜Müller细胞活力,这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。     

补肾活血中药复方对AGEs及缺氧状态下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

目的观察补肾活血中药对体外晚期糖基化终末产物(AGEs)及缺氧条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法采用SD大鼠制备补肾活血中药含药血清和空白血清,以终浓度为1 mmol/L的连二亚硫酸钠制作细胞缺氧环境,以终浓度50 mg/L的AGEs作为低AGEs条件,终浓度100 mg/L的AGEs作为高AGEs条件,将体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞分为6组,分别置于加入空白血清、中药含药血清、空白血清+低AGEs+连二亚硫酸钠、空白血清+高AGEs+连二亚硫酸钠、中药含药血清+低AGEs+连二亚硫酸钠、中药含药血清+高AGEs+连二亚硫酸钠的DMEM培养基中,培养48 h后检测各组乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,比较差异。结果 (1)低AGEs+缺氧组较正常对照组LDH值有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05);高AGEs+缺氧组较正常对照组LDH值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。(2)正常中药干预组LDH数值与正常对照组接近,差异无统计学意义(P0.05)。(3)两组不同剂量AGEs+缺氧中药干预组LDH漏出量均较对应的低、高AGEs+缺氧组明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论 AGEs及缺氧条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞细胞膜稳定性下降,通透性增加,细胞活力降低,补肾活血中药含药血清可提高AGEs及缺氧条件下视网膜Müller细胞活力,这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(DR)的机制之一。     

活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下 对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响

目的 研究活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸(GLU)环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达及活性的影响。方法 将40只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,每组10只。银杏叶组予银杏叶片水溶剂5. 2 mg/kg灌胃,活血通络利水方低剂量组予活血通络利水方合剂20 g/kg灌胃,活血通络利水方高剂量组予活血通络利水方合剂40 g/kg灌胃,正常组予等容积0. 9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃7 d后,腹主动脉取血后离心收集血清备用。培养Müller细胞,分别用不同浓度的GLU(0、0. 1、0. 5、1、10、20、25、30 mmol/L)干预24 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测Müller细胞存活率。Müller细胞分为正常组、模型组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,正常组和模型组每孔加入正常血清0. 5 m L、培养基2 m L,银杏叶组每孔加入银杏叶含药血清0. 5 m L、培养基2 m L,活血通络利水方低、高剂量组每孔分别加入活血通络利水方20、40 g/kg含药血清0. 5 m L、培养基2 m L。除正常组外,其余4组均加入GLU 25 mmol/L。相同条件下培养24 h后提取总蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot)检测各组Müller细胞中GLAST、GS蛋白表达水平;用高效液相色谱法(HPLC)检测各组细胞培养液中GLU含量。结果 MTT实验结果显示,GLU干预24 h后,与0 mmol/L浓度GLU比较,10 mmol/L及以下低浓度GLU细胞存活率升高(P 0. 05); 20、25、30 mmol/L浓度GLU细胞存活率逐渐降低(P 0. 05),其中25 mmol/L浓度GLU细胞存活率下降至约0. 67。Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组GLAST、GS蛋白表达水平均降低(P 0. 05);与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组GLAST、GS蛋白表达水平均升高(P 0. 05),且活血通络利水方高剂量组的上调高于银杏叶组(P 0. 05),与正常组比较差异无统计学意义(P0. 05)。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示,与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组的胞外GLU含量均降低(P 0. 05);与银杏叶组比较,活血通络利水方低、高剂量组Müller细胞胞外GLU含量比较差异无统计学意义(P0. 05)。结论 在25 mmol/L GLU浓度环境下,活血通络利水方能够上调Müller细胞GLAST、GS蛋白表达和活性,促进细胞摄取胞外GLU,以维持GLU代谢平衡。     

艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用

目的:研究艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞(RMCs)增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将培养的RMCs分为正常对照组、甘露醇对照组、模型组、罗格列酮阳性对照组及艳山姜挥发油高(1μg/L)、中(0.5μg/L)、低(0.25μg/L)浓度组。给药48 h后,MTT法检测艳山姜挥发油对高糖诱导RMCs增殖的影响,苏木素-伊红染色(HE)进行形态学观察,划痕修复实验及transwell实验分别分析RMCs迁移能力和侵袭能力。免疫印迹法(Western blot)分析血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:高糖作用后,RMCs增殖率、迁移及侵袭能力显著升高(P<0.01);VEGF蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,给予艳山姜挥发油及罗格列酮预保护能显著抑制RMCs的异常增殖(P<0.05),RMCs形态和数量趋近正常对照组,RMCs迁移和侵袭能力显著降低,同时显著下调了VEGF蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:艳山姜挥发油对高糖诱导下RMCs的增殖及VEGF蛋白的表达具有调控作用。     

补肾活血泄浊汤有效成分对大鼠系膜细胞TGF-βmRNA表达的影响

目的:研究补肾活血泄浊汤有效成分对体外培养大鼠系膜细胞 TGF-β基因表达的影响,以探讨补肾活血泄浊汤治疗肾小球肾炎的机制。方法:应用20%胎牛血清刺激系膜细胞,分别加入补肾活血泄浊汤有效成分川芎嗪、大黄素、灵芝多糖,应用 Northern 杂交技术,观察上述几种中药有效成分对大鼠系膜细胞 TGF-β基因表达的影响。结果:川芎嗪、大黄素、灵芝多糖均可抑制 TGF-β基因的表达,其中以川芎嗪作用最为显著。结论:补肾活血泄浊汤可能通过抑制 TGF-β基因的表达而减轻肾小球硬化。     

补肾中药对膝骨关节炎软骨TGF-β1表达的影响

目的:探讨补肾中药对膝骨关节炎软骨TGF-β1表达的影响.方法:48只雌性SD大鼠,造模成功后,随机分为4组:中药组、芬必得组、模型组、正常对照组.2、4周分别处死6只,原位杂交法检测膝骨关节炎关节软骨TGF-β1表达.结果:中药组TGF-β1表达明显强于其他组.结论:通过上调TGF-β1表达,补肾中药具有一定修复和延缓膝骨关节炎关节软骨退变的作用.     

糖肾汤对高糖下肾小球系膜细胞TGF-β1表达影响的实验研究

目的：观察高糖对肾小球系膜细胞TGF-β1蛋白及mRNA表达的影响，以及糖肾汤的干预作用。方法：分别用低糖、高糖以及高糖下糖肾汤不同剂量培养肾小球系膜细胞，采用ELISA法测定TGF-β1蛋白含量，逆转录-多聚合酶链反应(RT-PCR)法测定TGF-β1ImRNA表达，并以开博通作为阳性药对照。结果：高糖可刺激肾小球系膜细胞TGF-β1蛋白及mRNA的表达，糖肾汤具有对抗高糖刺激作用，且呈现一定的量效关系。结论：糖肾汤对高糖对肾小球系膜细胞的影响具有干预作用。     

人参皂苷对糖基化终末产物条件下视网膜Müller细胞活力的影响

目的：探讨人参皂苷对糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法：以改良酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将纯化培养的视网膜Müller细胞分别置于低剂量AGEs（终质量浓度为75 mg·L^-1）及高剂量AGEs（终质量浓度为150 mg·L^-1）下进行培养,并分别以人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁及人参皂苷提取物干预。在干预24,48,72 h后以酶联免疫吸附法测定各组细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出量,以推测Müller细胞活力。结果：低AGEs组24,48 h的LDH漏出量较正常对照组均无明显差异,但72 h的LDH漏出量较正常对照组增多（P<0.05）;高AGEs组各时段LDH漏出量均较正常对照组以及低AGEs组增多（P<0.05）;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物均能减少低AGEs组48,72 h的LDH漏出量（P<0.05）,减少高AGEs组各时段的LDH漏出量（P<0.05）。结论：AGEs能明显增加视网膜Müller细胞膜的通透性,降低细胞活力,并且与干预的时间、浓度有关;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物能降低本实验中AGEs条件下Müller细胞膜的通透性、提高Müller细胞膜稳定性,增强细胞活力,尤其以人参皂苷提取物效果显著。     

补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜神经节细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察补肾活血中药对SD大鼠慢性高眼压(elevated intraocular pressure,EIOP)模型视网膜神经节细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。方法:采用烙闭上巩膜静脉法,制作大鼠慢性EIOP模型,随机分为模型对照组,补肾活血高剂量组、中剂量组、低剂量组,空白对照组。连续灌胃8周,并于8周末处死大鼠,观察其对EIOP大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡基因的影响。结果:补肾活血中药可上调大鼠EIOP视网膜神经节细胞抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促进基因Bax。结论:补肾活血中药可调控大鼠EIOP视网膜神经节细胞凋亡基因的表达。     

糖肾1号方含药血清对高糖环境下培养的HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FNmRNA和蛋白水平的影响

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制。[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组。高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平。[结果]1)与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。2)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。3)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05),糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。4)与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组。