构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

包裹pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备以及特性研究

摘要 背景：壳聚糖是生物可降解性天然多糖，其生物相容性好，安全无毒，故而在基因成为基因传递方面展现巨大潜力。 目的：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，观察研究其相关特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2009-02/2009-08在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70由国家卫生部纳米生物技术重点实验室构建，壳聚糖 (批号060306，上海伯奥生物科技有限公司,脱乙酰度>90.0%,粘度<100cps) ，B16细胞由中南大学肿瘤研究所惠赠。 方法：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞，利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外转染效果；应用噻唑蓝(MTT)评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性。 主要观察指标：激光粒度仪测定壳聚糖基因纳米粒径、Zeta电位；紫外分光光度计检测包封率；凝胶阻滞实验观察壳聚糖和质粒DNA的聚合；DNaseⅠ的保护试验分析壳聚糖基因纳米粒抗核酸酶降解能力。 结果：壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,zeta电位为16mV; DNA包封率为92.3%，B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine 2000相近, 而其毒性远低于Lipofectamine 2000。 结论：壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞,而且对细胞基本无毒。     

壳聚糖季铵盐作为基因递送载体的初步研究**

背景：非病毒载体因其安全性好而在基因治疗领域赢得了广泛的关注,各种各样的非病毒载体处在不断的研究中,壳聚糖季铵盐作为一种新的生物材料,同样也具有作为基因递送载体的潜质。 目的：考察壳聚糖季铵盐体外基因转染活性,寻求一种新的非病毒基因载体递送系统。 设计、时间及单位：对比观察实验,于2008-04/12在浙江省医学科学院生物工程所完成。 材料：质粒pcDNA3.1-EGFP为浙江省医学科学院生物工程实验室保存。以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐,用复凝聚法制备载基因纳米粒。 方法：凝胶阻滞实验分析壳聚糖季铵盐包裹质粒的能力,DNase I的保护实验分析载基因纳米粒的抵抗核酸酶降解的能力,体外基因转染实验评价纳米粒的体外转染活性,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪测定转染结果。通过考察转染液中有无牛血清和递送不同剂量的基因对转染效率的影响,寻求本递送系统较好的转染条件。另外,用MTT法测定壳聚糖季铵盐的细胞毒性。 主要观察指标：壳聚糖季铵盐和pcDNA 3.1-EGFP以何种比例结合形成的纳米粒、转染液中有无牛血清,质粒的量为多少时对人胚肾T细胞的转染效率是最高的;不同浓度的壳聚糖季铵盐对细胞生长的影响。 结果：壳聚糖季铵盐纳米粒能转入人胚肾T细胞,虽然转染效率略逊于聚乙烯亚胺,但是细胞毒性明显小于聚乙烯亚胺。壳聚糖季铵盐纳米粒转染细胞72 h后效率较高,经综合分析,当pcDNA质量为2 μg,壳聚糖季铵盐和pcDNA以质量比为5结合形成的纳米粒,在无血清条件下对人胚肾T细胞进行转染,转染效率是最高的。 结论：壳聚糖季铵盐纳米粒能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖季铵盐用做基因递送的载体系统值得进一步的研究。     

聚酰胺树形分子高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸诱导血管内皮细胞凋亡*☆

目的：观察聚酰胺树形分子高聚合物作为survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，asODN）传递系统的可行性以及对人脐血管内皮细胞的survivin表达、细胞生长的影响。 方法：实验于2005-05/2006-03在上海交通大学微纳米科学技术研究院微纳制造技术国家重点实验室完成。①将200 μg/L surviving-asODN和3.66 μg/L 聚酰胺制备聚酰胺反义基因复合物，同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照。②透射电镜观察复合物的形态、粒径，zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位，离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率、载药率和体外DNA释放速度。③将上述两种基因载体复合物转染人脐血管内皮细胞，测定其转染效率；Western blotting检测转染后细胞中survivin蛋白的表达；流式细胞术检测两组细胞的凋亡率。 结果：①成功制备聚酰胺反义基因载体系统聚酰胺-survivin-asODN。该复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物 (P < 0.01)，但zeta电位高于后者（P < 0.05）；两者基因载药率、包封率无显著差异（P > 0.05）；聚酰胺对DNA持续释放14 d，但脂质体只持续5 d。②聚酰胺-survivin-asODN 转染人脐血管内皮细胞的效果强于脂质体-survivin-asODN（P < 0.05），转染后人脐血管内皮细胞siurvivin蛋白的表达低于脂质体复合物（P < 0.05），该细胞的凋亡率高于脂质体复合物（P < 0.05）。 结论：聚酰胺能将Survivin-asODN高效递送到人脐血管内皮细胞，降低survivin蛋白的表达并诱导血管内皮细胞凋亡。     

聚酰胺纳米分子介导survivin反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡☆

背景：传统的病毒载体及非病毒载体在基因治疗中均存在明显的缺点,采用纳米材料作为反义寡核苷酸载体有望获得更好更安全的基因转导,提高基因治疗的有效性和安全性。实验拟采用聚酰胺纳米分子介导反义寡核苷酸阻断survivin表达,诱导大肠癌凋亡。 目的：探讨聚酰胺树形分子高聚合物介导survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligonucleotide,survivin-asODN)转染结直肠癌SW620细胞的可行性以及对结直肠癌SW620细胞survivin表达、细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：肿瘤基因治疗体外实验,于2007-09/2008-05在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成。 材料：人结直肠癌细胞株SW620购自中国科学院上海细胞研究所,聚酰胺树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室崔大祥教授提供,转染试剂脂质体LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司。survivin-asODN由上海生工公司合成。 方法：采用300 µg/L survivin-asODN和4.06 µg/L聚酰胺制备聚酰胺反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照。透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的的包封率、载药率和体外DNA释放速度。将上述两种基因转染复合物转染结直肠癌细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后细胞中survivin蛋白的表达;流式细胞术检测两组细胞的凋亡率。 主要观察指标：阳离子脂质体-survivin- asODN复合物及聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率。 结果：聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P < 0.01),但zeta电位高于后者(P < 0.05);基因载药率、包封率两组差异无显著性意义;聚酰胺对DNA持续释放14 d,但脂质体只持续5 d。聚酰胺-survivin-asODN 转染结直肠癌细胞的效果强于脂质体- survivin-asODN(P < 0.05)。转染后结直肠癌细胞survivin蛋白的表达低于脂质体复合物(P < 0.05),细胞的凋亡率高于脂质体复合物(P < 0.05)。 结论：聚酰胺能将survivin-asODN高效递送到结直肠癌SW620细胞,降低survivin蛋白表达并诱导结直肠癌细胞凋亡。 关键词：聚酰胺树形分子高聚合物;反义寡核苷酸;结直肠癌;Survivin; 凋亡     

壳聚糖氧化铁纳米颗粒包裹MDR1 shRNA与对胶质瘤细胞转染的影响

目的探讨多药耐药基因短发卡RNA（MDRl shRNA）与壳聚糖氧化铁（Fe304）纳米颗粒对胶质瘤细胞系转染的影响。方法设计并合成针对MDRl的shRNA序列与pSIREN—RetroQ质粒载体连接,提取质粒,制备壳聚糖纳米颗粒并包裹制备的质粒,测定包封率及粒径分布。培养人类胶质母细胞瘤BT325共转染,测定转染效率。结果质粒pSIREN—RetroQ—RNAi经双酶切后测序验证,与实验设计的shRNA长度相符。壳聚糖一铁纳米粒子的粒径为100～300mm。分布较均匀．包裹质粒DNA包封率为97％-99％。壳聚糖Fe304纳米粒子包裹质粒经PI试剂转染BT325细胞,在共转染24h开始表达,荧光显微镜下呈绿色荧光,48h表达最强。转染效率为70％-80％（P〈0．05）。结论MDRlshRNA表达质粒与壳聚糖Fe3O4纳米粒子结合,可提高胶质瘤细胞系BT325转染效率,转染后细胞可以正常生长,可以为进一步的靶向基因检测及治疗提供有意义的思路。     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的表面修饰和转染研究

目的：比较不同物质修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的物理化学性质,并考察它们体外基因转染活性,以寻求一种新的非病毒基因载体递送系统。方法：用乳化聚合法制备不同物质修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒,透射电镜观察表面修饰对纳米粒粒径大小、粒子形态的影响;利用体外转染实验考察表面修饰对纳米粒转染活性的影响;用倒置荧光显微镜观察并用流式细胞仪测定转染结果。结果：经壳聚糖表面修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒带有很强的正电荷,能够转染人肝癌细胞HepG2细胞,并且转染效率高于葡聚糖和mPEG-NH2修饰的纳米粒,也能防止DNase I酶的降解。结论：壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒能有效地将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒用做基因递送的载体系统值得进一步的研究。     

新型阳离子脂质体制备及其体外转基因特征

背景：阳离子脂质体及胶束、纳米粒等转基因载体是目前非病毒转基因载体领域研究热点;而目前市售转基因试剂盒价格昂贵,并且基本上都是进口商品,如果能够开发一种价廉,转基因效率高,具有自主知识产权的转基因试剂盒将展现广阔市场前景。 目的：合成一种新型阳离子脂质复合物,并制备相应阳离子脂质体,对其体外转基因效率进行考察。 方法：以1-乙基-3- (3-二甲胺丙基)碳二亚胺、胆固醇、丁二酸酐为原料合成阳离子脂质复合物,采用薄层色谱、红外光谱等方法对产物进行结构表征。然后用薄膜分散法,将适当比例的二油酰磷脂酰乙醇胺和阳离子脂质复合物混合制备成阳离子脂质体,并用其包封含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFPC1,对人宫颈癌Hela细胞株进行体外转染。 结果与结论：通过两步法合成了一种全新的阳离子脂质复合物——胆固醇-丁二酸酯-1-乙基-3- (3-二甲胺丙基)碳二亚胺,薄层色谱及红外光谱结果表明合成了预期产物。薄膜分散法制得阳离子脂质体,其中以这种阳离子脂质复合物和二油酰磷脂酰乙醇胺摩尔比为1∶1左右所制备的脂质体颗粒较为均匀、细小,形态基本呈圆形。体外对质粒包裹实验结果表明,阳离子脂质体与质粒比为5∶3,可完全包封质粒。用该阳离子脂质体对Hela细胞进行转染,24 h后,瞬时转染效率达35.6%。从初步实验结果看,所合成的阳离子脂质复合物结构总体与市售阳性成分结构类似,合成方法简单、廉价,体外对质粒DNA有很好包裹性能,细胞毒性低,然而体外对Hela细胞的转染效率还明显偏低。     

纳米高聚合物转导Survivin反义寡核苷酸对大肠癌的体内杀伤作用*

背景：近年来纳米载体已被视为突破基因转移瓶颈最有前途的技术之一。聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)是一种新型的纳米材料,体内外实验表明,PAMAM比其他阳离子载体的基因转染效率高、细胞毒性低。 目的：探讨PAMAM介导Survivin反义寡核苷酸(Survivin antisense oligonucleotide,Survivin-asODN)对结直肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用。 设计、时间及地点：肿瘤基因治疗体内实验,于2008-02/08在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成。 材料：人结直肠癌细胞株SW620购自中科院上海细胞所,PAMAM树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室提供,脂质体LipolifectmainTM2000购自美国Invitrogen公司。Survivin-asODN由上海生工公司合成。 方法：将PAMAM和阳离子脂质体分别与Survivin-asODN混合得到载反义基因转染复合物。透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率和体外DNA释放速度。将对数生长期的人结直肠癌细胞SW620细胞接种于18只Balb/C裸鼠皮下建立结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机均分为脂质体组、PAMAM组和空白对照组。分别注射脂质体-survivin-asODN转染复合物、PAMAM-survivin-asODN转染复合物、血清培养液,观察两组移植瘤体积,Western bloting方法检测移植瘤组织中survivin基因的表达。 主要观察指标：阳离脂质体-survivin-asODN复合物及PAMAM-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率,种植肿瘤生长抑制率,移植瘤细胞Survivin蛋白的表达及活性。 结果：PAMAM-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P < 0.01),而zeta电位高于PAMAM- survivin-asODN复合物zeta电位(P < 0.05),基因包封率两组差异无显著性意义。PAMAM对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d。PAMAM- survivin- asODN复合物治疗组裸鼠移植瘤survivin蛋白表达低于脂质体-survivin- asODN复合物组(P < 0.05)。PAMAM- survivin-asODN复合物治疗组移植瘤体积低于脂质体-survivin-asODN复合物组(P < 0.05)。 结论：PAMAM能将Survivin-asODN高效递送到结直肠癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,抑制移植瘤生长。 关键词：聚酰胺-胺型树枝状高聚合物;结直肠癌;反义寡核苷酸;Survivin doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.045     

阳离子脂质体介导的基因转移机制

基因治疗在有效进行遗传性和获得性疾病治疗方面,取得重要进展。与病毒载体相比,许多天然的和合成的阳离子类脂以脂质体的形式用于基因转移,具有无免疫原性、易生产、质粒免受核酸酶降解、无致瘤性等优点。作为病毒载体的有效替代,阳离子类脂被用于细胞的体内和体外转染。类脂构效关系的研究和基因转移机理的揭示是提高转染效率和优化基因治疗的关键。本文综述了阳离子脂质体介导的基因转移机理：阳离子脂质体/DNA复合物的形成,细胞吸收,内含体释放和复合物解体,细胞核摄入。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

Ultrasound microbubbles combined with liposome-mediated pNogo-R shRNA delivery into neural stem cells

In the present study, ultrasound-mediated microbubble destruction (UMMD) alone and combined with liposome technology was used as a novel nonviral technique to transfect a Nogo receptor (Nogo-R) shRNA plasmid (pNogo-R shRNA) into neural stem cells (NSCs). Using green fluorescent protein as a reporter gene, transfection efficiency of NSCs was significantly higher in the group transfected with UMMD combined with liposomes compared with that of the group transfected with UMMD or liposomes alone, and did not affect cell vitality. In addition, Nogo-R mRNA and protein expression was dramatically decreased in the UMMD combined with liposome-mediated group compared with that of other groups after 24 hours of transfection. The UMMD technique combined with liposomes is a noninvasive gene transfer method, which showed minimal effects on cell viability and effectively increased transfer of Nogo-R shRNA into NSCs.     

脂质体介导EGFP基因转染神经干细胞实验研究

目的用增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达载体pIRES2-EGFP转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),检测该真核表达载体对NSCs的转染效率及EGFP的表达状态,为用NSCs为载体基因治疗中枢神经系统疾病提供实验依据。方法体外扩增、酶切鉴定pIRES2-EGFP质粒;悬浮培养NSCs;阳离子脂质体lipofectam ineTM2000介导增强绿色荧光蛋白质粒转染NSCs;庆大霉素的氨基糖苷(G418)筛选重组子;荧光显微镜观察转染效率及表达情况;免疫细胞化学鉴定重组子。结果转染后6 h,荧光蛋白偶见表达,24 h表达量明显增加,48 h达到最高峰,1个月后抗性细胞有克隆球形成。结论脂质体介导报告基因—pIRES2-EGFP转染NSCs的方法简单、效率高、易成功,是一较为理想的基因转染方法。     

阳离子聚合物载体介导脑源性神经营养因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞

BACKGROUND： Gene therapy is an effective expression of genes within target cells after transferring exogenous target genes. Both vector selection and transfection method are important factors for gene transfection. An ideal gene vector is required for a high transfusion of target gene and an exact introduction of target gene into specific target cells so as to express gene products.
OBJECTIVE： To study the expression of mRNA and protein after transfecting rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） with brain-derived neurotrophic factor （BDNF） genes based on cationic polymer vector.
DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled in vitro study using gene engineering, performed at the Neurobiology Laboratory, Xuzhou Medical College between October 2007 and April 2008.
MATERIALS： PcDNA3.1 BDNF was obtained from Youbiai Biotechnological Company, Beijing and cationic polymer vector used was the SofastTM gene transfection reagent that was made by Taiyangma Biotechnological Co., Ltd., Xiamen.
METHODS： BMSCs extracted from six Sprague Dawley （SD） rats aged 1 month were isolated and cultured in vitro. Third passage BMSCs were inoculated on a 6-well culture plate at the density of 1×106 cells/L. At about 80% confluence, BMSCs were transfected with PcDNA3.1-BDNF （2 μg） combined with SofastTM gene transfection reagent （6 μg） （BDNF group） or with PcDNA3.1 （2 μg） combined with SofastTM gene transfection reagent （6 μg） （blank vector group）. Cells that were not transfected with any reagents but still cultured under primary culture conditions were used as a non-transfection group.
MAIN OUTCOME MEASURES： Enzyme linked immunosorbent assay was used to measure time efficiency of BMSC-secreted BDNF protein. Twenty-four hours after gene transfection, RT-PCR was used to detect expression of BDNF mRNA in the BMSCs. Immunohistochemistry was used to determine expression of BDNF protein in the BMSCs.
RESULTS： BDNF protein expression was detected at day 1 after gene transfection, rapidly increased after 5–9 days and gradually increased after 11–15 days in the BDNF group; moreover, BDNF protein expression was higher than that in the non-transfection group and the blank vector group at different time points （P 〈 0.01）. Additionally, BDNF mRNA expression in the BDNF group was higher than that in the blank vector group and the non-transfection group （P 〈 0.01）.
CONCLUSION： A cationic polymer vector can effectively mediate the BDNF gene to transfect BMSCs; genetically modified BMSCs can express BDNF protein effectively for a long term.     

NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法构建NEDD4-1 shRNA表达载体。以不同比例质粒和脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜观察细胞存活情况,优化转染效率。转染48 h后采用Western blot、RT-PCR分别检测NEDD4-1蛋白及mRNA的表达,流式细胞术检测细胞周期,MTT法检测细胞增殖,DAPI荧光染色检测细胞凋亡。结果 NEDD4-1 shRNA表达载体构建成功。脂质体与质粒的最佳转染效率比例为2.5μl∶1μg,48 h转染效率在60%～70%。与对照组比较,转染NEDD4-1 shRNA后,U251胶质瘤细胞NEDD4-1的蛋白及mRNA表达水平均下降(均P<0.05),细胞大多停滞在G0-G1期(均P<0.05),增殖率明显降低(均P<0.05),凋亡率显著增加(均P<0.05)。结论 NEDD4-1作为PTEN泛素连接酶,为胶质瘤基因治疗提供靶点。