SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。     

前列腺癌中DD3的表达及意义

目的 检测DD3 mRNA在前列腺癌中的表达,探讨其在前列腺癌诊断中的作用,并分析其与前列腺癌临床分期和病理分级之间的关系.方法 采用SYBR-Green I实时荧光定量RT-PCR.法检测DD3 mRNA在34例前列腺癌、20例前列腺增生组织及3种前列腺癌细胞株中的表达,同时收集临床病例数据,分析其表达含量与临床分期和病理分级之间的关系,应用SPSS13.0对数据进行统计分析.结果 ①DD3 mRNA在前列腺癌组织和前列腺癌细胞株中的表达量明显升高,与其在前列腺增生组织中的表达量相比,差异具有显著性(P<0.001).②在不同的临床分期与病理分级中,DD3 mRNA的表达量随临床分期和病理分级增加而增加,其差异亦具有显著性(P<0.001).结论 DD3 mRNA在前列腺癌中呈高表达,可作为前列腺癌的一项特异性早期诊断标记物,其与前列腺癌的临床分期和病理分级具有相关性,提示其有可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用.     

DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量检测对前列腺特异性抗原灰区前列腺癌诊断的临床价值

目的研究前列腺组织中DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量检测在前列腺特异性抗原(PSA)灰区前列腺癌临床诊断中的应用价值。方法选择sPSA 4~10 ng/ml的前列腺增生(BPH)患者1 12例和前列腺癌(PC)患者25例,进行RT-PCR、PSA检测、B型超声检查及前列腺穿刺活检。观察其DD3 mRNA、DD3 mRNA/D、血清PSA(sPSA)、前列腺穿刺活检标本PSA(uPSA)、总PSA/游离PSA比值(f/tPSA)、s/uPSA、PSA密度(PSAD)等参数的差异,并应用ROC曲线分析各参数的诊断价值。结果 2组患者年龄、前列腺体积比较差异无统计学意义(t=12.87、12.31,P>0.05);tPSA、PSAD比较差异均有统计学意义(t=7.31、6.89,P<0.05);PC组DD3 mRNA/PSA mRNA比值明显高于BPH组(t=7.86,P=0.009);PC组DD3 mRNA/D比值明显高于BPH组(t=7.28,P=0.05)。ROC曲线分析结果表明,以0.27为截断值,DD3 mRNA/PSA mRNA的曲线下面积为0.841(95%C1 0.666~0.997);以2.01为截断值,DD3 mRNA/D的曲线下面积为0.907(95%C1 0.790~0.869)。结论 DD3 mRNA含量、DD3 mRNA/D定量检测可以显著提高检出PSA灰区前列腺癌的敏感度,对PSA灰区前列腺癌的早期筛查诊断意义重大,DD3 mRNA/D具有更好的诊断效能。     

前列腺液中DD3mRNA定量检测无侵入性诊断前列腺癌的意义

目的探讨前列腺按摩后前列腺液沉渣中DD3mRNA含量在前列腺癌诊断中的应用价值。方法在前列腺穿刺活检前或术前麻醉后收集前列腺按摩后患者的前列腺液。其中前列腺癌（Pca）患者31例,前列腺增生患者（BPH）59例,离心取细胞沉淀物,用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real time RT-PCR）方法检测DD3mRNA和PSAmRNA含量,以PSAmRNA作为管家基因校正前列腺液沉渣中的前列腺细胞,以DD3mRNA/PSAmRNA比值表示DD3mRNA含量。SPSS 13.0分析相关数据,以穿刺活检或术后病理检查结果为金标准,用受试者工作特征曲线（ROC）对DD3mRNA诊断性能进行分析,并与血清tPSA进行比较,同时探讨前列腺液DD3mRNA相对定量值阳性率与病理分级的关系。结果前列腺癌患者前列腺液DD3mRNA表达量明显高于BPH,差异具有统计学意义（P〈0.05）。ROC曲线分析结果显示,曲线下面积（ROC-AUC）=0.879（95%CI=0.795～0.964）。DD3mRNA相对定量值截断值取0.015313时,其诊断效能最大。其灵敏度为0.806,特异度为0.864,准确性0.67,阳性预测值75.8%,阴性预测值89.5%,阳性似然比、阴性似然比分别为5.97、0.224。若血清tPSA分别以4ng/ml和10ng/ml为截断值时,灵敏度分别为83.8%和54.84%,特异度分别为61.02%和83.05%,不同病理分级之间DD3mRNA的阳性率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论前列腺液中DD3mRNA测定的诊断性能明显高于血清PSA,作为前列腺癌的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。     

前列腺癌患者前列腺癌基因3的表达

目的评价前列腺癌基因3（PCA3）在前列腺癌诊断中的临床应用价值。方法选取我院2009年11月~2010年11月收治的30例前列腺癌（前列腺癌组）、22例前列腺增生（前列腺增生组）患者及12例健康男性（对照组）,采用逆转录聚合酶链式反应方法检测其外周血中PCA3 mRNA表达情况。结果对照组及前列腺增生组外周血标本中未见PCA3 mRNA阳性表达,而前列腺癌组患者外周血标本中PCA3 mRNA阳性率为99.3%（28/30）,差异有高度统计学意义（χ2=65.283,P〈0.01）。结论前列腺癌中PCA3 mRNA有明显组织特异性的阳性表达,有望成为前列腺癌诊断的新肿瘤标志物。     

前列腺癌特异DD3基因实时荧光定量PCR检测方法建立及初步应用

目的：建立实时荧光定量PCR检测特异DD3基因方法,探讨其在前列腺癌早期诊断中的应用价值．方法：根据Genebank中的DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,构建用于制备DD3基因检测的定量标准品的克隆载体;建立DD3基因的实时荧光定量方法,分别用于前列腺癌患者全血、尿液、前列腺液标本的检测．结果：经稳定性、特异性、重复性和敏感性实验评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1．64×10^3拷贝／L,线性范围为1．64×10^3～1．64×10^15拷贝／L．对临床收集的19份前列腺癌患者,20份非前列腺癌患者、30份健康者的全血、尿液及前列腺液标本进行检测．19份前列腺癌患者标本中阳性率分别为100％（全血）、80％（尿液）、100％（前列腺液）;20份非前列腺癌患者标本中只有1份前列腺液出现低拷贝值（1×10^5拷贝／L）;30份健康者标本均为阴性．在全血、尿液、前列腺液标本中,前列腺癌患者DD3 mRNA含量明显高于非前列腺癌患者和健康者（P〈0．05）．结论：DD3基因是一种用于前列腺癌早期诊断的特异性指标,可用于生物体液中少量癌细胞的检测,在前列腺癌早期诊断、微转移诊断、预后判断、指导治疗等方面均具有潜在的应用价值．     

DNA甲基化酶抑制剂对前列腺癌中XAF1 mRNA表达的影响

目的 探讨前列腺癌中XAF1mRNA表达及DNA甲基化抑制剂对其表达的影响.方法 培养前列腺癌细胞株LNCaP、DU145和PC3及肾癌细胞株A498,提取正常人外周血单核细胞(PBMC)、A498和PBMC用作阳性对照.搜集临床10例前列腺癌及邻近前列腺组织作对照.RT-PCR法检测各细胞株和正常人外周血单核细胞中XAF1 mRNA表达,甲基化特异性PCR法检测甲基化酶抑制剂(5'-aza)处理前后前列腺癌细胞株LNCaP、DU145中XAF1 mRNA表达.结果 LNCaP和DU145中XAF1 mRNA的表达水平低于肾癌细胞株A498,PC3中XAF1 mRNA不表达.8例患者中有6例XAF1 mRNA在癌组织中的表达低于邻近前列腺组织.使用5'-aza处理后的LNCaP和DU145中XAF1 mRNA均以全长形式表达.结论 XAF1mRNA在LNCaP和DU14中均为低表达,在PC3不表达.DNA 5'-aza可诱导前列腺癌细胞株中XAF1 mRNA的全长表达.     

Claudin-3 mRNA在前列腺癌组织中的表达及意义

目的探讨Claudin-3 mRNA在前列腺癌组织中的表达及其意义。方法应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测34例前列腺癌组织和12例前列腺增生组织的claudin-3 mRNA的转录水平,并结合相关指标进行分析。结果Clau-din-3 mRNA在前列腺癌组织中的表达明显高于良性前列腺增生组织,差异有显著性(p<0.05)。Claudin-3 mRNA在前列腺癌中的表达与肿瘤病理分级和TNM分期无相关关系(p>0.05)。结论Claudin-3 mRNA表达上调可能与前列腺癌的发生相关。     

外周血差异显示编码3mRNA定量检测在前列腺癌患者诊断与治疗监测中的初步应用

目的探讨外周血差异显示编码3（DD3）mRNA定量检测在前列腺癌诊断和治疗监测中意义。方法用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR）方法对35例未治疗前列腺癌、58例内分泌治疗后前列腺癌、59例良性前列腺增生患者和10例健康男性志愿者外周血DD3mRNA含量进行定量检测,并对DD3mRNA诊断及疗效监测价值进行评价。结果未治疗前列腺癌组外周血DD3mRNA含量明显高于治疗后前列腺癌组、前列腺增生组和健康男性志愿者组,差异具有统计学意义（P〈0．01）。未治疗前列腺癌患者随着临床分期增加,外周血DD3mRNA含量也增高,差异具有统计学意义（P〈0．01）。当临界值为846拷贝／ml时,DD3mRNA曲线下面积为0．822（95％CI：0．725～0．919）,灵敏度、特异度分别为74．3％、89．8％。结论外周血DD3mRNA定量检测是前列腺癌诊断的良好指标,可作为内分泌治疗过程疗效监测的指标。     

HER-2 mRNA值在前列腺癌中的表达和意义

目的 以实时荧光定量PCR技术研究BPH与PCa组织标本以及前列腺癌细胞株LNCaP、PC-3中HER-2 mRNA值的表达,探讨HER-2在前列腺癌诊断的特异性意义.方法 通过实时荧光定量PCK对23例PCa、37例BPH、31例前列腺癌LNCaP细胞株、22例前列腺癌PC-3细胞株和3例正常前列腺组织HER-2 mRNA的表达,比较其mRNA值定量的差异.结果 Pca、LNCaP和PC-3样品HER-2 mRNA表达值与BPH及NT组织差异有显著性(P<0.05).结论 实时荧光PT-PCR定量检测HER-2 mRNA为前列腺癌的诊断、治疗、预后监测等提供了更为可靠的辅助指标.     

双重实时荧光逆转录聚合酶链反应检测尿液DD3/PSA mRNA比值及其应用

目的建立双重实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测尿液DD3／PSAmRNA比值,评价其初步应用。方法分别在前列腺特异性抗原（PSA）基因外显子1和2、差异显示编码3（DD3）基因外显子1和3之间设计一对引物和一条探针,PSA和DD3基因的TaqMan—MGB探针5’分别标记HEX和FAM荧光素,建立双重实时荧光RT—PCR检测尿液DD3／PSAmRNA比值的方法,并对方法学进行评价。对34例前列腺癌（PCa）、44例良性前列腺增生（BPH）患者前列腺按摩后尿液中的DD3／PSAmRNA比值进行检测,评价其临床应用价值。结果扩增产物经测序证明为PSA和DD3特异性片段。以LNCaP细胞cDNA作模板,PSAmRNA和DD3mRNA最低检测限分别为0,6细胞／反应和60细胞／反应。DD3／PSAmRNA比值批内、批间变异系数分别为3．8％-4,7％和4．1％-4,9％。PCa组尿液DD3／PSAmRNA比值明显高于BPH组（P〈0．01）。尿液DD3／PSAmRNA比值诊断PCa的ROC曲线下面积（AUC）为0．746（95％CI：0．630—0．862）,当截断值为0．254时其敏感度和特异度分别为64．7％和77.3％,其阳性率与临床和病理分级均无关。结论成功建立了双重实时荧光RT—PCR检测尿液DD3／PSAmRNA比值的分子生物学诊断方法。该方法对PCa诊断具有较高特异度和敏感度,且节省操作时间、降低实验成本,有望成为PCa早期诊断的有效方法。     

3-T MR扩散加权成像诊断前列腺癌最优b值探究

目的 以磁共振超声融合靶向穿刺联合系统穿刺病理结果为金标准,探究3-T MR扩散加权成像(DWI)诊断前列腺癌的最优b值.方法 前瞻性招募临床拟诊为前列腺癌的患者43例,于穿刺前行包括常规T2WI及10个b值(0、50、100、150、200、500、800、1 000、1 500、2 000 s/mm2)DWI在内的MR检查.采用DWI联合T2WI对病灶进行分析判断,根据MR诊断结果选择穿刺方式.MR提示有可疑病灶者行靶向穿刺联合系统穿刺,未提示可疑灶者行单纯系统穿刺.选择病理确诊为前列腺癌的患者,测量不同b值病灶及正常组织的DWI信号强度.采用Wilcoxon Signed Ranks非参数配对检验分析不同b值病灶和正常组织信号强度差异是否具有统计学意义,采用受试者工作特征(ROC)曲线计算各b值诊断曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性.结果 入组病例共43例,22例确诊为前列腺癌,16例为良性前列腺增生,5例为前列腺炎.在确诊为前列腺癌的22例中,16例病灶在b值为1 500 s/mm2 DWI上显示较为清晰,6例病灶在b值为2 000 s/mm2 DWI上显示较为清晰.Wilcoxon Signed Ranks结果显示当b值为500 s/mm2时病灶和正常组织信号强度差异无统计学意义(P=0.236),在其他b值图像上病灶和正常组织信号强度差异均有统计学意义(P＜0.000 1).ROC曲线分析提示b值为1 500s/mm2时AUC最大(0.933).当诊断的信号强度cut-off值为49.2时,诊断的敏感性和特异性分别为0.909和0.909.结论 3-T MR DWI在b值为1 500 s/mm2时具有最佳显示病灶能力,在b值为500 s/mm2时无法区分诊断前列腺癌与正常组织.     

尿液中PCA3评分对前列腺癌早期诊断的临床意义

目的：探讨不同尿液中前列腺癌基因3 （PCA3）评分的截断值对可疑前列腺癌患者诊断的应用价值.方法：纳入123例因血清总前列腺特异性抗原（t-PSA）升高和（或）直肠指诊（DRE）异常住院的患者,采集前列腺按摩后的初始尿液标本,使用实时定量PCR检测尿沉渣中PSA及PCA3 mRNA的表达,测定穿刺前尿样PCA3的评分.结合穿刺的病理结果分析不同尿PCA3评分的截断值对诊断前列腺癌的敏感性和特异性（阳性预测和阴性预测）.结果：经穿刺病理结果证实前列腺癌32例,前列腺良性增生91例.当取PCA3评分截断值为35时,可避免52.7％（48例）的患者进行不必要的穿刺,8.8％（8例）的患者被漏诊（被漏诊的患者均是低危前列腺癌）;当取PCA3评分截断值为50时,可避免72.5％（66例）的患者进行不必要的穿刺,但13.2％（12例）的患者被漏诊,且2例（16.7％）是中高危前列腺癌.结论：检测可疑前列腺癌患者尿液中PCA3评分可减少不必要的穿刺,且取截断值为35时可获得较高的诊断价值.     

PKCzeta在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞增殖的影响

目的 检测PKCzeta在不同分级前列腺癌(PCa)组织的表达情况,并探究PKCzeta的表达对前列腺癌细胞系增殖的影响.方法 采用免疫组织化学染色法检测19例前列腺癌组织和4例正常前列腺组织的PKC-zeta表达情况,并按肿瘤分级分为3组,进行PKCzeta表达的差异性分析;应用Hilymax试剂转染PKCzeta质粒(CA-PKCzeta)过表达前列腺癌细胞PKCzeta;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot分别检测PC3和DU145细胞内PKCzeta的mRNA和蛋白水平;利用平板克隆形成试验和CCK-8试剂盒检测PC3和DU145细胞增殖能力的差异以及转染PKCzeta质粒后细胞增殖的变化.结果 PKCzeta在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P＜0.05),而且低分级(1级)前列腺癌PKCzeta的表达高于高分级(2～3级)前列腺癌(P＜0.05).DU145细胞的PKCzeta表达高于PC3细胞,而其增殖速度较PC3细胞低;过表达PKCzeta使前列腺癌细胞系的增殖受抑.结论PKCzeta与肿瘤分级存在负相关关系,在癌症早期可能有一定的保护作用,且过表达PKCzeta能抑制前列腺癌细胞的增殖.     

CT与MRI认知融合影像在经腹会阴直肠切除术后患者经会阴前列腺靶向穿刺中的应用

目的 探究磁共振融合CT引导下经会阴前列腺靶向穿刺技术在无肛门患者中的应用。方法 对2例APR术后检查发现血清PSA异常升高的患者行磁共振融合CT引导下前列腺靶向穿刺技术。穿刺前先对2名患者进行多参数前列腺MRI,操作者通过目视估测,判断目标病灶位置。随后穿刺者对目测所得病灶靶向穿刺,其中患者1还进行了12针系统性穿刺,穿刺所取得的前列腺组织送病理检查,以病理结果为最终诊断。结果 患者1病理提示良性前列腺组织;患者2病理提示前列腺腺癌,Gleason评分3+4=7。结论 磁共振融合CT引导下经会阴前列腺靶向穿刺技术在无肛门患者中的应用是可行的,但这一技术的敏感性与特异性则有赖于进一步研究。     

移行区前列腺特异性抗原密度诊断前列腺癌的应用研究

目的探讨移行区前列腺特异性抗原密度（PSATZ）诊断前列腺癌（PCa）的价值。方法选取血清前列腺特异性抗原（PSA≥4ng/ml）和（或）指检阳性（digital rectal exami-nation,DRE）患者行经直肠超声（transrec-tal ultrasonography,TRUS）检查,并经手术病理或自动活检枪行系统穿刺活检证实的79例患者进行分析。通过与血清PSA和前列腺特异性抗原密度（PSAD）对比,分析PSATZ诊断前列腺癌的敏感性和特异性。结果PSA、PS-AD、PSATZ三者相比,PSATZ优于血清PSA、PSAD,故PSATZ是较佳的PCa检测指标,具有最大的ROC曲线下面积和较高的特异性。结论PSATZ法优于血清PSA及PSAD法,用移行区体积对PSA进行校正具有一定价值。故在进行PCa筛选时,应在经直肠超声检查的基础上,有必要对于PSATZ大于0.35ng/（ml·cm^3）的患者进行超声引导下穿刺活检（Ultrasound-guided prostatic biopsies）。