对负载人胶质瘤冻融抗原的树突状细胞功能的实验研究

目的 建立从人外周血诱导扩增树突状细胞(DC)的方法，并探讨冻融抗原制备的DC疫苗在CTL对胶质瘤细胞杀伤效应中的作用与效率。方法 将从人外周血分离出单核细胞(PBMC)进行培养，用GM—CSF和IL—4培养7一14d后，进行鉴定；在DC培养的第7d，加入自体胶质瘤细胞的冻融抗原以致敏DC，用MTT、乳酸脱氢酶法检测DC刺激T细胞的增殖作用和负载冻融抗原后的DC疫苗对自体CTL杀伤活性的诱导作用。结果 PBMC在培养7-14d后可获得大量的DC，该DC能够强烈的激发自体T淋巴细胞增殖，负载冻融抗原后的DC疫苗能有效地诱导自体CTL的杀伤活性。结论 用该方法可以获得大量较纯的DC而满足临床应用的需要；用冻融抗原制备的DC疫苗有很强的免疫活性，具有较高的临床应用价值。     

负载U251抗原树突状细胞增强CIK杀伤作用的实验研究

目的 探讨负载脑胶质瘤细胞株(U251)蛋白抗原的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)混合培养后对U251细胞杀伤活性的影响. 方法 提取U251的肿瘤抗原,采用脐血单个核细胞(CBMCs)诱导DC和CIK,用负载肿瘤抗原的DC和CIK共同培养诱导为Ag-DC-CIK;通过形态学和免疫分子表型鉴定成熟的DC;采用MTT法检测CBMCs、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对U251的杀伤活性. 结果 成熟的DC高度表达CD86(82.66%)、CD40(69.40%),中度表达CD83(57.49%)和CD80(51.14%);Ag-DC-CIK对U251细胞的杀伤活性(58.78±6.56%)高于CBMCs(29.71±6.99%)、CIK(39.89±9.42%)、Ag-CIK(49.92±4.34%),差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 负载U251抗原的DC能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为颅内肿瘤的免疫治疗提供了新思路.     

负载hTERTC27基因的树突状细胞对胶质瘤细胞的杀伤效应

目的 探讨负载hTERTC27基因的树突状细胞(dendritic cells,DCs)治疗胶质瘤的可行性.方法 利用重组腺病毒(recombinant adenovirus,Adv)将hTERTC27基因转染到DCs,Western blot杂交鉴定hTERTC27蛋白的表达.实验分为3组:hTERTC27转染的DCs,单纯强化绿荧光蛋白(EGFP)转染的DCs和单纯的DCs.CCK8法检测各组DCs对淋巴细胞的增殖作用及诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)对胶质瘤细胞U87的杀伤活性,ELISA法检测T细胞上清中白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的表达.结果 hTERTC27转染的DCs组对T细胞的增殖作用以及T细胞上清IL-2、IFN-γ的浓度均高于其余两组,当效靶比为40∶1时,这组T细胞对U87的杀伤率(50.4% ± 2.95%),也明显高于EGFP转染DCs组(38.0% ± 1.81%)以及单纯DCs组(33.7% ± 2.03%)(P ＝ 0.001).结论 hTERTC27基因转染的DCs能诱导CTL反应,对端粒酶阳性的U87具有显著的杀伤效应.     

树突状细胞疫苗治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

近年来随着对树突状细胞（dendriticcells，DCs）研究的不断深入，其在肿瘤抗原提呈和肿瘤免疫中重要作用逐渐被揭示，开拓了肿瘤免疫治疗的又一新领域。DCs是目前已知的抗原加工与提呈功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），也是唯一能刺激纯真T细胞的抗原提呈细胞，而T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤免疫中起重要的主导作用田。据此，本实验采用细胞因子诱导骨髓细胞分化为DC，以C6细胞裂解物致敏DC制备疫苗，再以该疫苗经颈内动脉、尾静脉、皮下三种不同注射途径回输荷C6脑胶质瘤大鼠，探讨其对荷瘤大鼠的免疫治疗效应，并试图从多种入药方式中寻找一种最为简便有效的方式，以便今后应用于临床工作。     

树突状细胞与脑胶质瘤

树突状细胞是一种抗原提呈细胞 ,通过将肿瘤抗原提呈给淋巴细胞来引发机体的抗肿瘤免疫反应 ,研究表明在以往认为缺乏树突状细胞的脑组织中也存在着树突状细胞 ,在中枢神经系统的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用 ,目前的实验充分证实了树突状细胞的抗瘤效应。本文就树突状细胞的特性、对胶质瘤的作用以及临床应用方法、前景等方面作一综述     

大鼠树突状细胞疫苗治疗脑胶质瘤的实验研究

目的研究树突状细胞疫苗对C6荷瘤大鼠的免疫治疗效应,并比较免疫治疗策略的异同。方法将成年健康SD大鼠40只平均分为4组,分别经RN A致敏和C6冻融抗原致敏的DC免疫以及对照组经未致敏D C和R PM I1640免疫,采用LD H试剂盒检测CTL的体外杀伤活性。建立大鼠C6脑胶质瘤颅内肿瘤模型,观察其生存期,并进行病理学检查。结果肿瘤RN A致敏的D C疫苗活性最强,与C6冻融抗原致敏的DC疫苗相比,CTL杀伤活性差异不显著(P>0.05),但与对照组相比,差异非常显著(P<0.01)。治疗组荷瘤大鼠生存时间与对照组相比,差异非常显著(P<0.01);两治疗组之间差异不显著(P>0.05)。治疗组肿瘤生长明显抑制。结论C6冻融抗原和肿瘤细胞R NA致敏的树突状细胞疫苗均是有效的免疫治疗方法。     

凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞瘤苗治疗大鼠颅内胶质瘤的实验研究

目的观察凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞(dendriticcell,DC)瘤苗对颅内胶质瘤免疫治疗的效果。方法通过立体定向接种建立Wistar大鼠C6胶质瘤动物模型;从大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF) 白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增获得功能性DCs;DCs经采用热诱导凋亡的C6胶质瘤细胞体外致敏后皮下回输荷瘤大鼠体内,1次/周,共5次。观察荷瘤大鼠的存活期,MRI观察颅内肿瘤生长情况,循环血中CD8 T淋巴细胞水平及体外细胞毒反应、增殖反应均以流式细胞仪检测。结果经过治疗的荷瘤大鼠生存期明显延长,MRI显示实验组大鼠肿瘤被明显抑制,外周血中CD8 T淋巴细胞比例增加,体外细胞毒试验提示经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗可以诱导针对C6胶质瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞,并且未观察到自身免疫反应的发生。结论经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗对于颅内胶质瘤是一种安全有效的治疗方法。     

干细胞样抗原提高树突状细胞介导胶质瘤免疫治疗的体外研究

目的 比较胶质瘤干细胞样抗原与非干细胞样抗原致敏树突状细胞(DCs)疫苗对胶质瘤的体外作用.方法 体外用无血清法和血清法培养恶性胶质瘤细胞,有限稀释法检测其克隆形成率;冻融法获取相应胶质瘤抗原;GM-CSF、IL-4体外诱导人外周血单核细胞获取DCs,与抗原孵育后再激活T淋巴细胞,同位素法检测效应细胞对胶质瘤细胞的杀伤率;流式细胞术检测DCs表面分子变化以及非贴壁细胞中T细胞比例的变化.结果 无血清培液中的胶质瘤细胞具有更高的克隆形成率(P<0.01);DCs经不同抗原刺激后HLA-A、HLA-DR、CD80、CD86表达上调(P<0.01);非贴壁细胞与DCs共培养后T细胞比例明显增高;干细胞样抗原激活的效应细胞对非干细胞样细胞和干细胞样细胞杀伤率分别为(70.2±5.13)%和(56.7±7.81)%(P<0.001),而非干细胞样抗原活化的效应细胞相应的杀伤率为(36.6±6.45)%和(9.05±3.49)%(P<0.001).结论 无血清培养液中的胶质瘤细胞具有更强的增殖能力,胶质瘤干细胞样抗原较传统抗原具有更强的抗原性,为进一步提高胶质瘤DCs疫苗疗效奠定基础.     

肿瘤抗原致敏树突状细胞瘤苗治疗颅内胶质瘤的实验研究

目的　研究肿瘤抗原致敏树突状细胞瘤苗治疗胶质瘤的疗效。方法　从大鼠的骨髓中加入GM CSF和IL 4培养树突状细胞 ,采用相差显微镜、扫描电镜观察了树突状细胞的形态学特点 ;免疫组织化学双标技术、流式细胞免疫学技术观察了其特异性抗体OX6和OX62 的表达 ;微酸洗脱方法抽提C6肿瘤抗原体外致敏树突状细胞 ,建立C6胶质瘤脑内动物模型 ,体内应用抗原致敏的树突状细胞 ,观察脑内肿瘤的疗效 ,并取致敏的动物的脾脏T细胞体外加入C6肿瘤抗原 ,加入IL 2培养进行CTL活性检测。结果　培养第 8天可见有典型的树突状细胞 ;免疫组织化学双标可见有OX6和OX62 阳性细胞 ,流式细胞免疫学分析发现OX62 阳性率为 93 0 3% ,OX6的阳性率为 92 0 1% ;体外细胞毒试验发现对相应的C6肿瘤细胞有明显的杀伤作用 ;动物实验发现实验组可见肿瘤组织内有大量的坏死 ,而对照组仅有少量的坏死 ,两者相比P <0 0 1。结论　体内注射采用微酸洗脱的抗原肽致敏树突状细胞瘤苗能够引起荷瘤动物脑肿瘤大面积的坏死 ,该方法为将来临床免疫治疗胶质瘤充分调动机体的免疫系统奠定基础。     

脑胶质瘤树突状细胞疫苗的研究现状及进展

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,约占颅内肿瘤的40%.尽管目前手术切除、放疗、化疗等治疗方法已有很大进展,但是胶质瘤病人预后仍然很差,特别是恶性胶质瘤,其平均生存期不足1年.     

瘤内注射树突状细胞对C6胶质瘤抑制作用的实验研究

目的通过构建SD大鼠脑胶质瘤模型,成瘤后瘤内注射树突状细胞,探讨树突状细胞对C6胶质瘤的抑制和诱导凋亡作用。方法 30只SD大鼠脑内注射C6细胞,成瘤后随机分3组。A组:沿原注射部位瘤内注入10μL培养液。B组:同法注入10μL含106个未成熟DC的培养液。C组:同法注入10μL含106个成熟DC的培养液。分析3组大鼠的生存时间;取不同组大鼠的脑内肿瘤,制作冰冻病理切片,染色后镜下观察;肿瘤组织制成细胞悬液后细胞爬片,免疫组化检测Fas在C6胶质瘤细胞中的表达,计算积分光密度值。结果 (1)生存时间:C组载瘤大鼠生存时间长于A、B 2组,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)肿瘤病理结果:C组肿瘤组织大片坏死区,B组小片坏死区,A组无明显坏死区。(3)免疫组化:Fas表达,细胞积分光密度值(IOD),C组明显高于A、B组。结论成熟DC可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,途径之一可能是增强抗原提呈,提高细胞Fas的表达。     

胶质瘤氩氦冻融产物负载树突状细胞对颅内胶质瘤大鼠的免疫治疗研究

目的 观察C6胶质瘤细胞经氩氦冷冻后,冻融产物对Wistar大鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DCs)成熟的影响,以及致敏的树突状细胞(DCs)对胶质瘤模型大鼠的抗肿瘤作用. 方法 体外常规培养C6胶质瘤细胞,双循环氩氦冷冻法冻融C6细胞悬液为实验组,只插入探针不作冷冻为阴性对照组,双循环氩氦冷冻法冻融等量PBS为空白对照组;应用重组大鼠白细胞介素-4(rmIL-4)、重组大鼠粒一巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导Wistar大鼠骨髓DCs成熟,培养第7天分别加入各组冷冻产物,48 h后光镜下观察DCs细胞形态,流式细胞仪检测各组DCs细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达,ELISA法检测各组上清液中IL-12含量;将C6细胞接种于Wistar大鼠建立荷脑胶质瘤模型,第3、10天分别皮下注射空白对照组、阴性对照组、实验组DCs疫苗,比较各组大鼠的中位生存期. 结果 培养第7天未成熟DCs加入冷冻产物48 h后实验组具有成熟DCs形态学特征,表面分子CD80、CD86阳性表达率、上清中[L-12的分泌量高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组DCs疫苗治疗后荷脑胶质瘤大鼠中位生存期高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 胶质瘤氩氦冻融产物可以诱导DCs成熟,介导大鼠脑胶质瘤的免疫治疗,为冷冻免疫机制提供一定理论基础,同时该DCs疫苗为胶质瘤个体化治疗的研究提供一种新的方法.     

靶向脑胶质瘤干细胞的树突状细胞疫苗治疗恶性脑胶质瘤的体外实验研究

目的 研究应用脑胶质瘤干细胞抗原制备的树突状细胞(DC)疫苗对胶质瘤细胞的杀伤作用.方法 反复冻融法获得源于胶质瘤细胞系U251中的肿瘤干细胞的胞溶物,和源于小鼠间充质干细胞的DC共培养,获得胶质瘤干细胞疫苗.流式细胞仪检测疫苗表面标志变化;CCK-8法检测其促T细胞增殖能力以及对胶质瘤细胞的靶向杀伤作用;ELISA法检测培养基中干扰素-γ的含量.用热处理U251细胞制备的DC疫苗作为对照组.结果 与对照组相比,脑胶质瘤干细胞疫苗的CD80、CD86、CD11c和MHC Ⅱ等表面标志表达显著提高,具有更强的促T细胞增殖能力(P＜0.01),对U251细胞特异性靶向杀伤率随效靶比的提高而增加,最高为(78.508±4.156)％,相应的干扰素-γ分泌水平也达到最高.结论 胶质瘤干细胞疫苗能更有效地诱导特异性细胞毒性T细胞,表现出更强的抗肿瘤特性.     

树突状细胞治疗脑胶质细胞瘤实验研究

目的研究树突状细胞疫苗瘤内注射对胶质瘤的治疗作用.方法建立大鼠C6脑胶质瘤皮下和颅内肿瘤模型,通过第一组为瘤内注射树突状细胞(DC)、第二组为腹部皮下注射DC、第三组为对照组,观察肿瘤生长情况和大鼠生存时间,比较细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性,并进行病理学检查.结果治疗组大鼠表现为肿瘤生长部分抑制,生存时间明显延长,与对照组比较,有极显著差异(P<0.01),瘤内注射DC和腹部皮下注射C6冻融抗原致敏DC,两治疗组间无显著性差异(P＝0.60);CTL杀伤活性增强,和对照组比较有显著性差异(P<0.05).双侧皮下种植的肿瘤治疗一侧后,生长均受到抑制,并逐渐缩小.结论瘤内注射DC治疗脑胶质瘤是一种新的、有效的免疫治疗策略.     

树突状细胞疫苗治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究

目的研究G422肿瘤细胞RNA体外冲击致敏的树突状细胞(DC)回输诱导体内产生保护性免疫反应及对颅内荷瘤小鼠的免疫治疗效应,探讨以树突状细胞为基础的疫苗对脑胶质瘤治疗的可行性.方法提取G422胶质母细胞瘤RNA或肿瘤提取物冲击致敏DC制成疫苗,分别进行免疫保护和免疫治疗的体内实验,以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外诱导及活性检测,并与PBS、未经致敏的DC、G422肿瘤细胞RNA组进行对照.疫苗能诱导产生针对G422肿瘤抗原特异性CTL,差异具有非常显著性(P＜0.01),接种疫苗后的小鼠能抵抗G422的再次攻击(P＜0.01),荷瘤小鼠接种疫苗后生存期较对照组延长(P＜0.05).结果疫苗能诱导产生针对G422肿瘤抗原特异性CTL,差异具有非常显著性(P＜0.01),接种疫苗后的小鼠能抵抗G422的再次攻击(P＜0.01),荷瘤小鼠接种疫苗后生存期较对照组延长(P＜0.05).结论肿瘤RNA或肿瘤提取物冲击致敏DC能诱导小鼠产生抗原特异性CTL,激活抗肿瘤T细胞,具有免疫保护和免疫治疗作用.该实验为DC疫苗免疫治疗胶质瘤提供了实验基础.     

胶质瘤树突状细胞融合疫苗诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞

在本研究中,我们检测树突状细胞(DC)与胶质瘤细胞U87融合是否会产生融合细胞,并确定此融合细胞是否会于体外诱导产生胶质瘤细胞U87特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。一、材料与方法1. 培养产生树突状细胞:从基因型为HLAA0201的健康人外周血中得到的单核细胞。分离CD14 单核细胞,重悬于10mlX-VIVO15培养液中,加入GM-CSF和IL-4。第5天,移走一半培养液,并加入相同体积的含有细胞因子GM-CSF和IL-4的新鲜培养液。第7天,应用冷的Hanks液收集DC并将其用做抗原递呈细胞。2. 树突状细胞的表型分析:在培养的第7天,流式细胞仪(FCM)检…     

树突状细胞和脑胶质瘤自体免疫治疗的实验和临床研究

一、材料与方法研究胶质瘤抗原树突状细胞(DC)疫苗的制备,并探讨其临床应用。从胶质瘤患者外周血中提取单个核细胞,用含10%自体血清的RPMI-1640加入GM-CSF和IL-4培养,获得DC。进行流式细胞学检测及光镜和电镜观察。分别用冻融法和紫外线照射法制备胶质瘤可溶性和凋亡抗原。检测不同DC疫苗诱导CTL体外杀伤活性的差别。选取2000年1月至2003年4月病理证实胶质瘤手术患者56例。其中II级25例、III级20例、IV级11例。将病人分为3组,均经同一手术组成员手术治疗,基本上为术中肉眼全切肿瘤,术后均接受常规剂量的放疗,均未接受化疗。实验…     

树突状细胞的培养及其诱导的神经胶质瘤体外杀伤作用研究

目的　研究负载肿瘤抗原的树突状细胞 (DCs)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)对神经胶质瘤细胞的体外杀伤效应 ,探讨其用于临床治疗的可行性。方法　体外原代培养 12例胶质瘤细胞 ,冻融法获取胶质瘤细胞抗原 ,联合应用粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 4和肿瘤坏死因子 α等 ,对人外周血单核细胞进行体外诱导来获取DCs并负载肿瘤抗原 ,激活自体T淋巴细胞 ,制备特异性CTLs,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果　负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤细胞有明显的杀伤作用 ,显著高于K5 6 2细胞对照组 ,并且杀伤率随着效靶比的增加而增加。结论　从人外周血中诱导的DCs负载胶质瘤抗原后 ,激活的CTLs在体外对胶质瘤能产生高效的杀伤作用 ,为临床应用DCs瘤苗奠定基础     

人胶质瘤干细胞样抗原致敏树突状细胞疫苗Ⅰ期临床试验研究

目的 探讨胶质瘤干细胞样抗原致敏DC疫苗在临床应用的可行性、安全性及有效性.方法 选取5例复发胶质瘤患者;二次手术后体外无血清培养胶质瘤细胞,CD133磁珠分选和X线照射后获取干细胞样抗原;同体外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4诱导后再与干细胞样抗原共孵育获得成熟DC疫苗;每周1次皮下接种DC疫苗,共3次,联合替莫唑胺化疗.观察不良反应,头颅MRI增强随访及生存期评估疗效.结果 5例胶质瘤标本中均含有不同比率的CD133+细胞,DC疫苗接种后患者无明显不良反应,患者平均生存期为72.2周.结论 干细胞样抗原致敏DC疫苗对于胶质瘤患者安全可行,联合化疗能延长患者生存期.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility ,safety and efficiency of dendritic cells (DCs) vaccine pulsed with tumor stem - like associated antigens against malignant glioma in recurrent patients.Method Cells derived from fresh specimens of recurrent gliomas in serum - free medium were magenetically sorted with CD133 -antibody and irradiated with X -ray to attain freeze -thaw lysates.Autologous DCs from mononuclear cells with GM-CSF and IL-4 were matured by the lysates.Five patients with recurrent glioma received the DCs vaccine once a week (3 times ) followed combination with chemotherapy after recurrent tumor resection.Follow - up was procedured with MRI scans and clinical protocol.Results Five malignant glioma cell lines contained different ratio of CD133 + cells.DCs were successfully prepared and applied in all patients.No side -effect was observed.Mean survival time was 72.2 weeks.Conclusions Combination of DCs vaccine and chemotherapy is safe and may benefit the patients with malignant glioma.