氢醌对人L-02肝细胞泛素连接酶Rad18表达的影响

目的 研究氧醌(hydroquinone,HQ)对人L-02肝细胞中泛素连接酶Pad18表达的影响,探讨Rad18在HQ所致肝细胞毒性中的作用及其可能机制.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160 μmol/L)的HQ作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率;用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况;实时荧光定量PCR技术检测Rad18在mRNA水平上的表达;Western blot方法检测Pad18在蛋白质水平上的表达.结果 在0-80 μmoFL的范嗣内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响,当染毒剂量超过160 μmol/L时,细胞存活率(79.20%)明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).随着 HQ作用浓度的升高,L-02肝细胞的Olive尾矩也逐渐增加,呈线性正相关关系(r=920,P<0.01).在HQ染毒剂量低于40μmol/L的范围内,Rad18在mRNA和蛋白质水平上的表达均有随着剂量的增加而增加的趋势;当HQ的剂量超过40 μmol/L时,Pad18在mRNA水平上的表达继续增加,而其在蛋白质水平上的表达则无明显变化.结论 HQ可使L-02肝细胞的Rad18表达增加.     

氢醌对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响

目的观察不同浓度氢醌(HQ)对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响,旨在探讨HQ对人体细胞毒性作用的分子机制。方法应用四甲基偶氮唑盐比色法检测不同浓度(0、5、10、20、40、80、160和320μmol/L)HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响;应用带有SYBRGreenⅠ的实时荧光定量聚合酶链反应技术研究不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)HQ对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响。结果在0~80μmol/L的范围内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0·05),当染毒剂量超过160μmol/L时,其存活率则明显地下降(P<0·01);在HQ染毒剂量低于80μmol/L的范围内,POLH基因mRNA表达有随着剂量的增加而增加的趋势,当HQ的剂量达到160μmol/L时,POLH基因mRNA的表达则有所降低,但仍高于对照组。结论HQ可以诱导L-02肝细胞内POLH基因在mRNA水平上的表达改变。     

氢醌对L-02肝细胞DNA损伤及细胞周期的影响

目的 探讨氢醌(HQ)对体外培养L-02肝细胞DNA损伤及细胞周期的影响.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)的HQ作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定L-02肝细胞的相对存活率,采用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测细胞DNA的损伤状况,并采用流式细胞术检测细胞周期分布状况.结果 在0～80 μmol/L的范围内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P＞0.05);当染毒剂量超过160μmol/L时,其存活率则明显地下降(P＜0.01).随着HQ作用浓度的升高,L-02肝细胞DNA链的断裂程度也随着逐渐增加.0～80μmol/L范围内的HQ作用24h后,L-02肝细胞的细胞周期也发生了明显的改变,表现为S期细胞比例明显增加,G1期细胞的比例下降.结论 HQ对L-02肝细胞DNA具有损伤作用,并且在体外能够引起明显的S期细胞阻滞.     

氢醌对人L-02肝细胞泛素结合酶Rad6B表达的影响

目的研究氢醌(HQ)对人L-02肝细胞中泛素结合酶Rad6B表达的影响。方法将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)的HQ处理24h之后,采用实时荧光定量PCR技术检测Rad6B在mRNA水平上的表达;采用Western blot方法检测Rad6B在蛋白质水平上的表达。结果在0～160μmol/L的范围内,HQ可诱导Rad6B在mRNA和蛋白质水平上表达的增加,具有随着剂量的增加而升高的趋势;并且各染毒剂量组(5、10、20、40、80和160μmol/L组)肝细胞Rad6B在mRNA和蛋白质水平上的表达均明显地高于对照组(0μmol/L组)(P<0.01);当HQ的作用浓度达到160μmol/L时,Rad6B的表达水平达到最大值,其mRNA和蛋白质表达的相对定量值分别为4.35和0.85。结论HQ可使L-02肝细胞的Rad6B表达增加。     

氢醌诱导下肝细胞XPV基因mRNA表达规律的研究

目的研究氢醌(HQ)对L-02肝细胞XPV基因mRNA表达的影响及其规律,探讨XPV基因在HQ所致肝细胞毒性过程中分子作用机制。方法体外培养的L-02肝细胞经40μmol/L的HQ诱导后,采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点(6、12、24和48h)XPV基因mRNA的表达;并检测不同剂量(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)HQ诱导24h后,各浓度组XPV基因mRNA的表达。结果在24h的时间范围内,XPV基因在mRNA水平上的表达无论是染毒组(40μmol/L)还是正常对照组,均具有随时间的延长而增加的趋势;到24h时,相对表达量达到最大值,当培养时间达到48h时,该基因的表达则有所下降;此外,在各时间处理组(6h、12h、24h和48h)中,染毒组L-02肝细胞内XPV基因在mRNA水平上的表达均高于正常对照组。各剂量HQ作用24h后,L-02肝细胞内XPV基因mRNA的表达在0～80μmol/L范围内随着剂量的增加而增加,以正常对照组XPV基因的相对表达量为1,各染毒剂量组内XPV基因mRNA的相对表达量分别增至1.20、2.02、2.37、2.67、4.40和2.32倍;80μmol/L时其相对表达量达到峰值,160μmol/L的HQ作用后,其表达却有所下降,但仍高于正常对照组。结论HQ可以诱导XPV基因mRNA的表达变化,并且呈现一定的时间和剂量依赖性,提示XPV基因可能参与了肝细胞对HQ的应答过程。     

氢醌诱导L-02肝细胞凋亡的研究

目的探讨氢醌(HQ)对体外培养L-02肝细胞凋亡(apoptosis)的影响和HQ毒性作用的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度HQ(0,5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后L-02肝细胞的相对存活率;采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测HQ染毒后的细胞凋亡状况。结果HQ在0~80μmol/L的染毒剂量范围内,对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05),当HQ染毒剂量超过160μmol/L时,L-02肝细胞的存活率则明显地下降(P<0.01)。10,20,40,80,160和320μmol/L组L-02肝细胞DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯状条带,并且随着HQ染毒剂量增加而渐趋明显。流式细胞术检测显示,HQ各染毒剂量组(5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后均可引起L-02肝细胞的调亡,并呈现出一定的剂量—反应关系;此外,还可出现明显的亚二倍体峰。结论HQ在体外能够诱导L-02肝细胞发生凋亡。     

氢醌对A549细胞人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶基因mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度氢醌(hydroquinone,HQ)对人肺腺癌A549细胞活性氧(reactiveoxygen species,ROS)、脂质过氧化损伤产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)、抗氧化酶活性以及氧化损伤修复酶人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human 8-oxo-guanine DNA glyeoslase,hOGG1)基因mRNA表达的影响,探讨HQ毒作用的分子机制.方法 不同浓度HQ作用于A549细胞,噻唑兰(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,荧光探针检测细胞内ROS的变化,比色法测定MDA含量和过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力,逆转录聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术分析hOGG1基因mRNA的表达.结果 随着HQ浓度的增加,各实验结果为:(1)A549细胞的吸光度值(A值)下降,160 μmol/L和320 μmoL/L浓度组[(0.584±0.098)、(0.328±0.066)]与对照组(0.989±0.150)相比差异有统计学意义(q值分别为5.56、9.07,P值均<0.05),且两组细胞存活率均低于80%;(2)A549细胞内ROS生成增多,40 μmol/L和80 μmoL/L浓度组A值[(39.80±4.15)、(101.99μ9.45)]与对照组(5.71±0.50)相比差异有统计学意义(q值分别为10.74、30.32,P值均<0.05);(3)SOD、GSH-Px活性下降,活性值在80 μmol/L时[(22.93±0.56)U/mg prot、(25.60±2.31)U/mg prot]均低于对照组[(25.62±0.28)U/mg prot、(38.97±2.61)U/mg prot],差异有统计学意义(q值分别为12.17、8.78,P值均<0.05);MDA含量升高,在40 μmol/L和80 μmol/L[(1.07±0.01)nmol/mg prot、(1.19±0.08)nmol/mg plot]时高于对照组[(0.77±0.04)nmol/mg prot],差异有统计学意义(q值分别为10.90、15.49,P值均<0.05);SOD(r=-0.95,F=20.00,P=0.04)与GSH-Px(r=-0.99,F=115.48,P=0.01)活力的下降和MDA(r=0.96,F=21.31,P=0.04)含量的升高均与HQ浓度的变化具有剂量-反应关系;(4)RT-PCR结果显示:HQ作用后,A549细胞hOGG1 mRNA的表达呈下降趋势,80 μmoL/L浓度组hOGG1 mRNA的表达(0.478±0.017)与对照组(0.715±0.038)相比降低较明显(q=11.70,P<0.05).结论 HQ可以诱导细胞活性氧增加和hOGG1基因mRNA表达水平下降,提示氧化损伤是HQ毒作用的重要机制.     

L-02肝细胞对氢醌所致DNA损伤耐受实验模型的初步建立

目的确定氢醌（hydroquinone,HQ）对L-02肝细胞的染毒剂量和染毒时间,从而为进一步的DNA损伤耐受机制研究提供科学依据。方法采用噻唑蓝（MTT）比色法测定不同浓度（0、5、10、20、40、80、160和320umol／L）的HQ于不同时间（6、12、24和48h）作用之后L-02肝细胞的相对存活率。结果在相同的作用时间（6、12或24h）条件下,在0-320umol／L范围内,随着HQ浓度的增加,各剂量组L-02肝细胞的存活率以剂量依赖性方式逐渐减少;其中160和320umol／L组L-02肝细胞的存活率与对照组相比较有明显地减少（P〈0．01）;而在48h时间组内,HQ染毒剂量达到80umol／L就可引起L-02肝细胞存活率的明显降低（P〈0．01）。在相同浓度（5、10、加和40umol／L）的HQ作用下,随着HQ作用时间的延长,各剂量组细胞的存活率之间差异没有统计学意义（P〉0．05）;当HQ染毒时间达到48h时,80、160和320umol／L的HQ染毒组L-02肝细胞的存活率与6h对照组比较有明显地减少（P〈0．01）。结论可以将80umol／L的HQ染毒24h作为L-02肝细胞耐受DNA损伤的最大剂量和最长时间的界限。     

氢醌对L-02肝细胞损伤的研究

[目的]探讨氢醌(HQ)对L-02肝细胞损伤及其可能的作用机制。[方法]应用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度分别为0、5、10、20、40、80、160和320gmol/L的HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响;利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒之后L-02肝细胞的形态学改变并摄影成像;利用全自动生化分析仪检测不同浓度HQ染毒24h后L-02肝细胞的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,以观察HQ对L-02肝细胞膜完整性的影响。[结果]在0～80μmol/L浓度的范围内染毒24h后,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05);浓度≥160μmol/L时,染毒24h后,存活率则明显下降(P<0.01),LDH漏出率、ALT和AST活性均有随着HQ浓度的增加而升高的趋势;160和320μmol/L组LDH漏出率与对照组比较有明显升高(P<0.01)。但ALT和AST活性只在320μmol/L组与对照组比较才有明显增加(P<0.01)。此外,160和320μmol/L组L-02肝细胞的形态与对照组相比发生了明显的改变。[结论]HQ可能是通过损伤细胞膜而对L-02肝细胞产生毒性影响。     

白血病相关原癌基因在氢醌处理TK6细胞中的表达

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的后续结果。方法用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测白血病相关原癌基因MPL、BRAF、ERBB2、MYB、MYC和RAF1的表达水平。结果与对照细胞相比,HQ处理细胞MPL和RAF1的mRNA表达量都随HQ剂量增加而上升,其中20μmol/L HQ对原癌基因表达的影响最为明显,分别上升了80%(P0.05)和35%(P0.05);MYB、MYC和ERBB2基因的mRNA表达量随HQ的剂量上升而下降。结论 MPL的转录活化很有可能与HQ导致的DNA整体低甲基化有关。     

氢醌对人支气管上皮细胞DNA损伤及细胞周期的影响

目的探讨氢醌(HQ)对体外培养人支气管上皮细胞DNA损伤及细胞周期的影响。方法将HBE细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80、160、320μmo/lL)的氢醌作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定16HBE细胞的相对存活率,用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测细胞DNA的损伤情况,流式细胞术检测细胞周期分布。结果在0～40μmo/lL范围内HQ作用24 h后,16HBE细胞的存活率未见明显变化(P>0.05);当染毒剂量超过80μmo/lL时,细胞存活率明显下降(P<0.01)。SCGE显示随着HQ浓度的升高,16HBE细胞的DNA断裂程度加重。HQ作用浓度在10～320μmo/lL范围内,16HBE细胞的细胞周期表现为G2期阻滞,G1期比例下降。结论 HQ会对16HBE细胞的DNA产生损害,并且引起G2期细胞阻滞。     

乙酸铅对脑脉络丛Z310细胞毒性作用

目的 初步探讨乙酸铅诱导大鼠脑脉络丛Z310细胞的低剂量兴奋作用和高剂量抑制作用。方法 以浓度为0、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2、20、200、500μmol/L的乙酸铅分别染毒Z310细胞12和24h,用噻唑蓝(MTT)法和2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)法检测细胞生存情况,并观察各剂量组细胞形态变化。结果 0.02μmol/L乙酸铅染毒24 h,MTT法检测Z310细胞存活率为107.06%,0.2μmol/L染毒组24 h时细胞存活率升高为110.91%;>2μmol/L乙酸铅染毒时,细胞存活率随剂量增加而降低;染毒24 h时,200、500μmol/L乙酸铅组细胞存活率(MTT法)分别下降至79.37%和76.81%(P<0.01);染毒12、24 h时,200、500μmol/L乙酸铅组细胞存活率(WST-8法)分别下降至81.67%和72.36%及56.89%和44.05%(P<0.05)。结论 低剂量乙酸铅可引起Z310细胞兴奋效应;高剂量乙酸铅引起Z310细胞抑制效应;WST-8法检测细胞存活率较MTT法更敏感。     

氢醌对人胚肺成纤维细胞中DNA及细胞核的影响

目的　研究氢醌 (HQ)对人胚肺成纤维细胞 (HLF)DNA及细胞核的损伤作用 ,探讨其遗传毒性。方法　分别用 0、10、2 0、4 0和 80 μmol/L的HQ染毒HLF细胞 3h ,用彗星试验检测DNA损伤。再用相同剂量组HQ染毒HLF细胞 1h ,继续培养 2 4h后进行微核试验。结果　彗星试验结果表明 ,各剂量组细胞DNA拖尾率分别为 12 %、19%、4 2 %、79%和 95 % ,彗星尾长分别为 7 87、9 35、11 0 3、19 2 8和 2 3 32 μm ,有明显的剂量效应关系 ,其中 2 0、4 0和 80 μmol/L剂量组的拖尾率和彗星尾长明显增加 ;且随着HQ剂量的升高 ,高度、重度DNA损伤的比例也逐渐增加。HQ也可致微核、核异常形成 ,各剂量组的微核率分别为 2 %、3%、10 %、9%和 15 % ,核异常率分别为 6 %、7%、16 %、2 7%和 2 8% ,剂量效应关系显著 ,其中 2 0、4 0和 80 μmol/L剂量组的微核率和核异常率显著增加。结论　HQ可致HLF细胞DNA和细胞核损伤 ,产生遗传毒性作用。     

小蘗碱诱导人宫颈癌Hela细胞株凋亡的作用

目的:探讨中药黄连素对子宫颈癌Hela细胞株的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法:以不同浓度的黄连素(10、20、40、80μmol/L),分12、24、48、72h四个时间点处理Hela细胞,光镜观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率;用透射电子显微镜及琼脂糖凝胶电泳检测凋亡发生情况。结果:黄连素可抑制Hela细胞增殖,作用呈明显的时效和量效关系,差异有统计学意义(P<0.01);黄连素可诱导Hela细胞凋亡,透射电子显微镜下可见凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA"梯状"条带。结论:黄连素体外对Hela细胞具有增殖抑制作用和促进凋亡作用。     

hOGG1基因低表达对氢醌的细胞毒性及遗传毒性的影响

目的 探讨hOGG1基因低表达对氢醌(HQ)的细胞毒性及遗传毒性的影响.方法 0、5、10、20、40、80μmol/L浓度的(HQ)染毒A549细胞和hOGG1基因低表达的A549-R细胞,噻唑蓝比色法检测2种细胞存活率,荧光法测定2种细胞内活性氧(ROS)含量,微核试验分析2种细胞染色体损伤,彗星试验观察细胞的DNA损伤和修复.结果 随着HQ染毒浓度的增加,2种细胞的存活率均下降,A549-R细胞和A549细胞IC50分别为160.49和228.42 μmol/L,且差异有统计学意义(P＜0.05).0、5、10、20、40、80 μmol/L HQ染毒组A549-R细胞ROS含量、微核率均明显高于A549细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);各浓度HQ染毒组A549-R细胞拖尾率和Olive尾距(OTM)值均明显大于A549细胞,并有剂量-反应关系,差异有统计学意义(P＜0.05).hOGG1基因低表达的A549-R细胞比A549细胞对HQ引起的DNA损伤修复更慢,修复2.0 h后才出现拖尾率和OTM值的明显降低,3.0 h后仍未完全修复.结论 氧化损伤可能是HQ毒作用的机制之一,hOGG1基因低表达可增加A549-R细胞对HQ的敏感性.     

氢醌对DNA甲基转移酶表达的影响

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的分子机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmo/lL HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平。结果与对照组相比,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达量在各HQ处理组细胞中均下降,其中以20.0μmo/lL组细胞的下降最为明显,分别下降46%(P0.05)、83%(P0.05)和48%(P0.05),且DNMT1和DNMT3a的表达量随着HQ剂量的增加而下降。结论 HQ致DNA整体低甲基化下调机制可能与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达异常有关。