体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

维甲酸和联合应用神经营养因子对新生大鼠神经干细胞分化的影响

目的研究全反式维甲酸（ATRA）及联合应用神经营养因子（BDNF，GDNF）对体外培养的神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法取新生SD大鼠的前脑室下带（SVZ）区，按NSCs的常规培养方法分离、培养。用免疫细胞化学法鉴定巢蛋白（nestin）、微管相关蛋白-2（MAP-2）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以此来观察ATRA、BDNF、GDNF单独或联合应用对次代神经球细胞分化的作用。结果原代及次代神经球均显示nestin阳性，并可分化为MAP-2阳性神经元样细胞及GFAP阳性胶质细胞样细胞。1μmol／LATRA可促进NSCs分化为MAP-2阳性细胞的比例达（29．14±5．00）％，显著高于对照组的（7．19±1．21）％，差异有高度统计学意义（P〈0．001）。ATRA联合应用10ng／ml的BDNF或GDNF，与单独使用ATRA比较，并不显著提高NSCs分化为MAP-2阳性细胞的比例。结论ATRA可促进神经干细胞向神经元方向分化，ATRA联合应用BDNF或GDNF无明显的协同作用。     

新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的体外研究

目的 探讨趋化因子受体CCR2在体外培养神经干细胞的表达.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性,可分化为NF200阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及CNP阳性少突胶质细胞,CCR2细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR2.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2,为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据.     

三七总皂甙诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的：用三七总皂甙（total Panax notoginseng saponins）在体外定向诱导SD青年鼠骨髓间质干细胞(mesenchy-mal stem cell，rMSC)分化为神经元样细胞。方法：用低糖DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶中。经体外扩增、纯化，选用第5代后的间质干细胞进行诱导分化。用10μg/LbFGF预诱导24h，更换成含三七总皂甙的无血清培养基DMEM诱导间质干细胞分化为神经元样细胞。用免疫组化SABC法鉴定神经丝蛋白（NF-M）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（nestin）、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：第5代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用三七总皂甙诱导30min到5h，间质干细胞体逐渐增大并伸出细长突起，形似神经细胞。免疫组化显示NF-M、NSE、MAP-2、GAP-43、nestin表达阳性，而GFAP阴性。结论：三七总皂甙可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

不同方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的观察两种方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向神经样细胞分化的效果。方法自大鼠股骨中提取骨髓细胞,利用Percoll法进行BMSC分离、纯化及鉴定。取第5代细胞,应用两种方法进行诱导。方法一（BHA组）：200μmol/L丁羟基茴香醚（BHA）、10 ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）和2%二甲基亚砜（DMSO）联合诱导细胞;方法二（RA组）：全反式维甲酸（RA）和β-巯基乙醇（β-ME）联合诱导细胞。同时设正常培养的BMSC为对照组。实验过程中对细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。结果BHA组诱导5 h,细胞即发生明显的形态改变,出现胞体回缩、突触伸展等神经干细胞的形态特征,而RA组诱导1周未出现神经干细胞形态。免疫荧光染色显示两种方法诱导的细胞均能表达神经前体细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达星形胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。BHA组与RA组表达NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对照组不表达NSE,诱导组与对照组比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为表达神经细胞标志物的神经样细胞。     

CNTF 联合RA 诱导成肌细胞类神经分化及与REST 的相关性

目的 探讨睫状神经营养因子（CNTF）联合视黄酸（RA）诱导成肌细胞类神经分化的方法以 及该诱导过程与神经元限制性沉默因子（REST）相关性。方法 以CNTF 诱导C2C12 去分化,再以RA 诱导 C2C12 类神经分化。通过细胞形态学、细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot 等技术对去分化及类神经 分化的细胞进行鉴定及相关分析,比较细胞类神经分化前后REST 表达变化。结果 诱导后细胞聚集生长,呈 典型的神经球样。细胞免疫荧光染色显示神经球能够被神经特异性标志物NSE、Sox1、GFAP 标记,神经球 离散为单个细胞接种后生长状态良好,神经干细胞标志物（nestin）呈阳性表达。Western blot 结果显示CNTF 去分化诱导后成肌细胞分化相关蛋白Myogenin、P21 表达降低,类神经分化后NSE、Sox1、GFAP 表达增多, 且成肌细胞特异性标志物Desmin 及REST 表达下降。流式细胞仪分析表面标志物NSE 显示诱导组与对照组 比较细胞有差异,且诱导组特异性阳性细胞率达84% 左右。结论 CNTF 联合RA 可诱导成肌细胞类神经分化, 且该诱导过程可能与REST 表达降低相关。     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响*

【目的】探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。【方法】培养胎鼠脑皮质神经干细胞，应用细胞免疫化学方法，以神经元特异性的微管相关蛋白-2（MAP-2）和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标记，对分化后的神经干细胞进行区分，评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。【结果】黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化，其中高剂量组明显优于对照组。【结论】黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1在O-2A谱系细胞中的表达

目的 观察O-2A（oligodentrocyte-type-2 astrocytes）谱系细胞是否是表达神经干细胞的标志物。方法 取新生大鼠脑皮质体外培养纯化的O-2A祖细胞、少突胶质细胞和2型星形胶质细胞,应用激光共聚焦双重免疫荧光标记技术检测巢蛋白（nestin）和阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）的表达。结果 nestin在O-2A祖细胞和2型星形胶质细胞中表达,在少突胶质细胞中不表达;SSEA-1仅在2型星形胶质细胞中表达。结论 nestin和SSEA-1在O-2A谱系细胞中的表达存在差异,可能具有神经干细胞的特征。     

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell,NSC）PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的促增殖、分化作用及其机制。方法:取孕16天SD胎鼠海马NSCs培养,分别设空白对照组,己烯雌酚1×10-7 mol/L组、1×10-8 mol/L组、1×10-9 mol/L组,以及脑源性神经营养因子(BDNF)5×10-2 mg/L组;免疫荧光化学方法检测Nestin、神经元特异烯醇化酶及神经胶质酸性蛋白的表达,RT-PCR检测BDNF mRNA的含量。结果:不同剂量己烯雌酚处理各组神经球面积、积分光密度值、平均突起长度与平均突起数均增加,其中10-8 mol/L组海马NSC增殖与分化最明显,BDNF mRNA表达量亦最高(P<0.01)。结论:己烯雌酚对海马NSCs的增殖分化具有促进作用,且可能与上调BDNF的表达有关。     

体外培养神经干细胞PDGF、EGF和GDNF的表达

目的为研究体外培养小鼠神经干细胞（NSC）血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的基因表达.方法取小鼠胚胎海马NSC培养并鉴定,提取其总RNA,用RT-PCR技术检测培养NSC内PDGF、EGF、GDNFmRNA的表达.结果培养NSC中PDGF mR-NA表达最强,EGF mRNA明显表达,但几乎未检测到GDNF mRNA.结论为了解NSC分泌神经营养因子发挥生物学作用提供了理论基础.     

体外培养神经干细胞CNTF、TGF-β1和IGF-1的表达

目的研究培养神经干细胞（NSC）中CNTF,TGF-β1,IGF-1基因表达情况.方法取小鼠胎鼠海马,分离纯化培养NSC,提取总RNA,RT-PCR技术检测CNTF,TGF-β1,IGF mRNA的表达情况.结果培养NSC中各因子mRNA均有表达;CNTF,TGF-β1表达较强,IGF-1表达较弱.结论体外培养的NSC表达CNTF,TGF-β1含量较高,可能是应用其治疗神经疾病的理论基础.     

脑衍生神经营养因子对胚胎神经干细胞神经细胞黏附分子的表达

目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）对胚胎神经干细胞神经细胞黏附分子（NCAM）表达的影响。方法：体外培养和鉴定SD大鼠海马胚胎神经干细胞,从而获得神经干细胞系。实验分为BDNF组和对照组,分别在培养后12 h和24 h对神经干细胞NCAM的表达进行免疫细胞组织化学检测,图象分析NCAM阳性个数、胞体面积、细胞周长。结果：来源于胚胎的神经干细胞增殖能力较强且Nestin阳性,神经干细胞能够表达NCAM,且BDNF组高于对照组,进一步观察发现BDNF组NCAM的各项参数值在24 h明显高于12 h（P〈0.05）。结论：BDNF能促进NCAM在神经干细胞中的表达。     

NMDA受体亚单位NR1在离体人神经干细胞中的表达

目的研究离体培养的人海马神经干细胞（NSCs）中NMDA受体亚单位NR1的表达。方法分离培养胎龄8-12周人胚脑海马神经干细胞,对NSCs进行Nestin和分化鉴定。用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹和RT—PCR等方法检测原代、传代1次、传代2次的人胚胎海马NSCs中NR1蛋白和mRNA的表达。结果在孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs中,NMDA受体亚单位NRI免疫细胞化学反应呈阳性,该受体亚单位的蛋白和mRNA均被检测钊。结论体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR1。     

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:随机选取新生1天(Q1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时.将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d后...     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

PDGF对人神经干细胞分化和甲状腺激素受体表达的影响

[目的]探讨血小板衍生生长因子(Platelet-derived Growth Factor,PDGF)在人神经干细胞(Human Neural Stem Cells,hNSCs)定向分化中的作用,以及在hNSCs分化过程中PDGF对甲状腺激素受体(Thyroid Hormonereceptors,TRs)的表达调控。[方法]用免疫细胞化学方法鉴定分化后的细胞类型,分别用半定量RTPCR法、 ELISA法检测不同诱导条件下hNSCs分化前后TRα1、TRα2、TRβ1在转录与翻译水平上的表达变化。 [结果]PDGF诱导hNSCs分化后NF阳性细胞约占80％;TRα1、α2、β1mRNA表达水平分别比10％胎牛血清诱导分化组上调约40％、30％、10％(P<0．05)。TRα、β蛋白质表达趋势为hNSCs>PDGF诱导分化组>血清诱导分化组(P<0．05)。[结论]PDGF能引发hNSCs向神经元分化,同时在转录与翻译水平上调hNSCs分化后TR各亚型的表达,增强甲状腺激素对中枢神经系统发育的重要调控作用。