RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

沉默id1基因表达对食道癌细胞Eca-109生物学行为的影响

目的 探讨靶向沉默分化抑制因子1基因(id1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒载体对食道癌细胞生物学行为的影响.方法 设计针对id1基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGFU6/neo质粒中.重组质粒转染食道癌细胞,RT-PCR检测id1基因mRNA的表达,Western blot检测Id1、p16及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达.台盼蓝染色、克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞增殖以及各周期分布.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的食道癌细胞id1 mRNA和蛋白的表达明显下降 (P<0.05),食道癌细胞增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例增加,而S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的id1 shRNA表达质粒能有效下调id1基因的表达和抑制食道癌细胞增殖.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

PDLIM5 shRNA质粒构建及其稳定转染SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建PDLIM5 shRNA真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y(成神经细胞瘤细胞)细胞系。方法合成PDLIM5基因干扰序列并插到RNAi真核表达载体p GFP-V-RS质粒中,通过酶切和测序进行鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒PDLIM5 shRNA和对照质粒PDLIM5 Scramble经脂质体Lipofectamine 2000介导转染SH-SY5Y细胞,经puromycin持续筛选和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。RT-PCR及Western blot分别检测PDLIM5 mRNA及蛋白表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组获得的干扰真核表达质粒PDLIM5 shRNA与预期完全相同。PDLIM5 shRNA稳定转染SH-SY5Y细胞在荧光显微镜下呈亮绿色。RT-PCR及Western blot检测显示PDLIM5 mRNA及蛋白表达明显下调。结论成功构建PDLIM5 shRNA真核表达载体及其稳定转染SH-SY5Y细胞系,为进一步研究PDLIM5在精神疾病中的功能奠定实验基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

COX-2 shRNA干扰载体的构建

目的:构建靶向COX-2基因的有效shRNA干扰载体并进行鉴定分析。方法:根据Genbank提供的COX-2 mRNA序列,使用Designer3.0(Genepharma)软件进行设计DNA oligo,构建并化学合成shRNA模板,用酶切和测序方法进行分析鉴定。结果:通过酶切和序列测定表明,成功构建了COX-2 shRNA表达载体。结论:构建的COX-2 shRNA干扰载体,为下一步转基因研究,探讨COX-2功能奠定基础。     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

siRNA抑制肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的研究

目的 研究siRNA对肝癌细胞株HepC2中Survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成一对Survivin编码基因的反向重复序列，中间间隔9个核苷酸序列，通过定向克隆至载体Psilencer2．1，构建siRNA真核表达载体，经稳定转染HepG2细胞后应用RT-PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中Survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。结果 测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT-PCR及流式细胞术检测，siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制Survivin基因表达分别达73％和75％。结论 构建的：Psilencer( )-Survivin重组质粒能有效抑制Survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

siRNA对HepG2细胞survivin表达的抑制作用

目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中survivin基因表达的抑制作用。 方法　设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体PSilencer 2 .1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。 结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的PSilencer( ) survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达 ,从而为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

shRNA抑制人骨髓间充质干细胞SMN1基因表达的研究

目的 构建在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的质粒,并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞全长SMN mRNA及蛋白的抑制作用,为进一步建立脊髓性肌萎缩症细胞模型提供实验依据。方法 根据GenBank中SMN1 cDNA序列设计5条SMN1靶向shRNA并将其克隆至pRNAT-156．1／Neo载体中U6启动子的下游,形成能在细胞内表达SMN1特异性短发夹状RNA的重组质粒pshRNA-SMN1;在脂质体介导下将重组质粒pshRNA-SMN1转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）,RT-PCR、Western印迹分别检测fl-SMNmRNA及fl-SMN蛋白的表达。结果 琼脂糖凝胶电泳及DNA测序证实重组质粒pshRNA-SMN1构建成功,其中pshRNA-SMN1-1组和pshRNA-SMN1-4组转染后明显抑制了hMSCsfl-SMNmRNA及蛋白的表达（均P〈0．05）,在mRNA水平上千扰效率分别为64．05％、61．04％,蛋白水平上干扰效率分别为52．97％和61．57％,而未影响△7-SMN mRNA的表达。结论 构建的pshRNA-SMN1重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞fl-SMNmRNA及蛋白的表达。     

Effect of siRNA Targeting Survivin Gene on the Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma

To study the influence of siRNA targeting survivin gene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma (HCC), one pair of 21bp reverse repeated motifs of survivin target sequence with 9 spacers were synthesized and inserted into plasmid psilencer2.1 to generate siRNA eukaryotic expression vector. After stable transfection into HepG2 cells, the biological behaviors of the survivin siRNA transfected HCC cells were observed. After the recombinant plasmid Psilence( )-survivin was successfully constructed, survivin mRNA and protein expression inhibition ratio reached 73% and 75% respectively compared to control groups. Transfected cells with survivin siRNA demonstrated significantly inhibited cell growth and increased apoptosis. Subsequent study in nude mouse model demonstrated lower succeeding rate in cells transfected with survivin siRNA and slow growth rate. The results elucidated the siRNA targeting survivin gene could specially suppress its expression in HepG2 cells and inhibit tumor cells growth both in vivo and in vitro. This provides a theoretical basis to turn the drug resistance in tumor cells.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

PML-RARα245-hIL-2双基因表达载体的构建和表达研究

目的：采用长度为245 bp的PML-RARα融合基因片段构建一种新的PML-RARα融合基因与人白介素-2（hIL-2）基因真核双表达质粒。方法：利用RT-PCR从NB4细胞的RNA中扩增出包含PML-RARα基因融合点的长度为245 bp的基因片段,通过RT-PCR从Jurkat细胞中扩增hIL-2基因,并将两基因片段分别克隆到pIRES质粒中,通过酶切和测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测该质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交和ELISA技术检测目的蛋白的表达。结果：Nhe I/Mlu I和Sal I/Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα融合基因片段和hIL-2基因,测序结果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将构建的pIRES-PML-RARα245-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录并翻译出相应蛋白。结论：成功构建了含有245 bp的PML-RARα基因与hIL-2基因的真核双表达载体,该载体能够在真核细胞中正常转录并翻译出PML-RARα和hIL-2蛋白,为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病提供了更丰富的资料。     

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的：构建针对呼吸道合胞病毒（RSV）M2基因mRNA的短发卡结构状RNA（shRNA）重组载体质粒，为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础；方法：按shRNA设计原则，选择RSV—M2基因作为靶基因，设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列，中间以9bp序列间隔，经退火形成互补双链，克隆至转录载体pgenesil-1上，重组质粒经酶切和测序鉴定，然后将构建成功的重组质粒转染HEP2细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果：将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上，经酶切及序列鉴定为目的序列，并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论：成功构建了针对RSVM2基因mRNA的shRNA重组载体质粒，可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制，从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。