人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

牙乳头细胞体外培养研究

在牙齿发育形成过程中，由神经嵴细胞迁移分化而来的牙乳头细胞，作为牙胚发育过程中唯一具有分化为成牙本质细胞的间充质细胞群体，扮演着重要的调节作用，受到口腔医学研究者的高度重视。由于体内原位研究的困难性，许多学者通过体外培养的方法来弥补这一缺憾。现将有关牙乳头细胞体外培养研究的资料综述回顾如下。１　牙乳头细胞培养类型和方法文献报告的牙乳头细胞体外培养主要有两种类型，一种是单层细胞培养，一种是组织器官培养。Ｋｏｌｌａｒ［１］在１９７２年就报道成功地进行了牙乳头细胞的单层培养，但未对细胞的表型特征进行描…     

牙囊细胞异质性研究

牙囊组织来源于外胚间充质,是牙骨质、牙槽骨及牙周膜的起源组织.牙囊组织并非均质性的细胞群体,而是含有干细胞和形成牙周组织的前体细胞等亚群,即牙囊细胞具有异质性.本文就牙囊细胞的异质性研究作一综述.     

牙乳头细胞基本特征及其研究进展

牙乳头细胞来源于外胚间充质,具有多向分化潜能,是体内唯一分化为成牙本质细胞的前体细胞。该细胞在牙发育和牙体牙髓损伤修复过程中起重要作用。牙乳头细胞相关的组织工程化研究是近年来的热点。下面就牙乳头细胞的形态及其功能特征、三维细胞培养、组织工程化牙研究进展等方面的研究作一综述。     

差速传代纯化大鼠牙囊细胞

目的:建立一种简捷的分离培养和纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法:分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚,剥离牙囊和成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用多次差速传代纯化牙囊细胞。结果:原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第4代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈长梭形或三角形,免疫组化染色抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论:利用多次差速传代可从混合培养的原代细胞中获得纯化的牙囊细胞。     

骨髓基质细胞亚群中多能性相关因子的表达和作用

目的通过检测体外培养人骨髓基质细胞(BMSCs)各细胞亚群中多能性相关因子Sox2、c-Myc和hTert表达水平的影响,探讨BMSCs各细胞亚群多能性和重编程能力的差异。方法采用有限稀释法克隆化培养BMSCs,从快速生长克隆、慢速生长克隆和混合培养BMSCs中各选择3个样本,免疫荧光染色检测Sox2、c-Myc和hTert表达,实时荧光定量聚合酶链反应检测Sox2、c-Myc和hTert mRNA表达,进行统计学分析。结果 Sox2在快速生长BMSCs细胞克隆为细胞核强表达,在其他各组为胞浆表达,Sox2 mRNA在快速生长细胞克隆表达显著高于其他各组(P<0.05)。c-Myc和hTert呈现相似的表达模式,在快速生长细胞克隆和混合培养BMSCs均为细胞核强表达,在慢速生长细胞克隆为胞浆表达,而三组间c-Myc和hTert mRNA表达水平均差异无统计学意义(P>0.05)。结论快速生长BMSCs细胞克隆中多能性相关因子Sox2表达高于慢速生长细胞克隆,提示细胞亚群的克隆形成能力可能与细胞多能性和重编程能力正相关,Sox2可能是细胞未分化性能的关键调控因子。c-Myc和hTert可能存在协同作用。     

大鼠牙囊细胞体外培养与表型鉴定

目的：体外培养大鼠牙囊细胞（RDFCs）,鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法：选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白（Vimentin,VIM）和角蛋白（Cytokeratin,CK）鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen,CoL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（typeⅢ collagen,CoL-Ⅲ）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。结果：细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示OPN、BSP、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论：大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。     

新生大鼠牙乳头细胞的体外培养和矿化特征

目的：观察体外培养的新生大鼠牙乳头细胞的生物学特征。方法：体外培养出生1d大鼠磨牙牙乳头细胞，进行组织学染色，透射扫描电镜观察。结果：体外培养的新生大鼠牙乳头细胞能形成细胞克隆，第3代细胞在含2mmol／L β-甘油磷酸钠、50mg／L抗坏血酸、10^-8moL/L地塞米松的培养液中培养7～8d后可呈现复层生长，培养14～16d后细胞结节中出现矿化，茜素红染色呈阳性反应；透射电镜观察细胞内出现大量含有致密小体的基质小泡样超微结构。结论：发育阶段较早的大鼠牙乳头细胞具有增殖和矿化能力。     

连续培养猪牙乳头细胞的免疫组化分析

目的探讨连续培养的牙乳头细胞的功能学特征。方法连续培养钟状期猪牙乳头细胞,应用间接法免疫组化检测各代细胞的牙本质涎蛋白（DSP）、核心结合因子1（Cbfa1）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）、骨桥蛋白（OPN）、骨粘蛋白（ON）、骨钙蛋白（OCN）等的表达情况,并以第4代猪骨髓基质细胞及人成纤维细胞作为对照组。结果免疫组化结果可见连续培养的各代猪牙乳头细胞均表达DSP、ColⅠ及ON,所有各代猪牙乳头细胞均未见OCN表达,ColⅢ只在第1代的少量细胞中有表达,Cbfa1及OPN在各代细胞中均有表达。结论体外培养的猪牙乳头细胞具有旺盛的分泌能力,可能具有形成钙化组织的潜能和形成牙本质样结构的可能性。     

大鼠牙乳头细胞旁分泌效应对巨噬细胞分泌炎症因子的调控作用

目的:研究大鼠牙乳头细胞(rat dental papilla cells,RDPCs)对LPS活化的巨噬细胞分泌免疫因子的影响.方法:分离SD大鼠牙胚,酶消化法原代培养牙乳头细胞并进行矿化诱导和成脂诱导,茜素红染色观察矿化结节形成.油红O染色观察脂滴形成.CCK8法检测大鼠牙乳头细胞条件培养基(rat dental papilla cells' conditioned medium,RDPC-CM)对巨噬细胞增殖能力的影响,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的影响,Griess reagent法检测RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子NO的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:原代培养24 h后,大鼠牙乳头细胞从组织块中爬出,传代后可得到纯化大鼠牙乳头细胞;茜素红染色见矿化诱导组中出现散在的红色矿化结节;油红O染色后可见经成脂诱导的牙乳头细胞中脂滴形成;CCK8结果表明,RDPC-CM对巨噬细胞增殖能力无影响;ELISA结果显示,大鼠牙乳头细胞条件培养基可对LPS活化巨噬细胞分泌细胞因子产生作用,表现为条件培养基作用于巨噬细胞24h可减少细胞分泌TNF-α,而对IL-1β和IL-6分泌无影响;Griess reagent法结果显示,RDPC-CM对LPS活化的巨噬细胞分泌NO无影响.结论:大鼠牙乳头细胞条件培养基作用于LPS活化的巨噬细胞,可使巨噬细胞分泌TNF-α下降,提示牙乳头细胞具有一定的免疫调控作用.     

人牙囊细胞的培养及其特性

目的：体外培养人牙囊细胞并研究其特性。方法：取年龄为12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊，组织块法进行人牙囊细胞的培养，HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态，免疫组织化学染色技术观察I型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形，形似成纤维细胞；扫描电镜可见细胞多呈梭形，也可见多角形，所有细胞表面均有颗粒状物质，有的细胞表面多且密，有的细胞表面较少，折光性较强，细胞核周围分布较多；在牙囊细胞中I型胶原和波形蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，围绕细胞核周围染色较强，细胞核内染色阴性。结论：体外可以培养人牙囊细胞，人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成I型胶原的能力。     

流体静压力作用下人牙囊细胞CSF-1的表达

目的：研究体外培养的人牙囊细胞在不同流体静压力作用下对细胞分泌CSF-1的影响，探讨CSF-1在牙齿萌出过程中的作用。方法：取12岁男孩埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养，将传代的培养细胞分别在50、100、150、200kPa流体静压力作用1h后再分别培养24、48、72h，使用ELISA方法观察细胞培养液中CSF-1的浓度。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形，主要为成纤维样细胞，细胞免疫组化染色显示人牙囊细胞中CSF-1的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，随流体静压力的增大染色增强，随压力的增大而增强。ELISA检测的CSF-1浓度随流体静压力的增大而增加，在一定的时间段内也随培养时间的延长而增加，具有时间性。结论：培养的人牙囊细胞具有合成与分泌CSF-1的能力，流体静压力可以促进体外培养的人牙囊细胞CSF-1的分泌。     

甲状旁腺激素对人牙乳头细胞牙本质基质蛋白1表达的影响

目的：观察甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)对体外培养的人牙乳头细胞(human dental papilla cells，HDPC)牙本质基质蛋白1(dental matrix protein，DMP1)合成分泌的影响。方法：原代方法培养出人牙乳头细胞，用不同浓度的甲状旁腺激素刺激培养的第5代人牙乳头细胞，免疫组化观察结果，并采用图像分析的方法，进行半定量分析。结果：PTH可刺激人牙乳头细胞DMP1的表达，诱导的DMP1主要表达于细胞胞浆内，呈一定的浓度依赖性，0．3μg／mL为刺激最佳浓度。结论：PTH能够刺激人牙乳头细胞产生DMP1，对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化有一定促进作用，可能是成牙本质细胞分化的重要介质之一。     

体外培养人牙囊细胞的生物学特性

目的 研究体外培养的人牙囊细胞的生物学特性.方法 分离18岁人埋伏阻生下颌第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,取不同代数细胞行HE染色观察细胞形态,MTS四唑盐比色法检测细胞增殖活性,茜素红染色定量分析成骨能力.结果 第9代细胞面积比第3代、第6代细胞面积显著增大(P＜0.05);第3、6、9代细胞增殖活性两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05);第3代细胞成骨能力明显强于第6代细胞(P＜0.05).结论 随着体外培养代数的增加,人牙囊细胞生物学特征发生明显变化,面积逐渐增大,增殖活性逐渐变缓,成骨分化潜力逐渐减弱.     

尼古丁对牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的：探讨尼古丁对牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶的影响。方法：彩和酶动法用不同浓度尼古丁硫酸盐在不同时间内作用于牙乳头间充质细胞，观察细胞A值的改变。结果：尼古丁硫酸盐抑制了碱性磷缓酶活性，并且与浓度和时间呈正相关关系。结论：尼古丁可抑制牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶的活性，可能对牙乳头间充 细胞伯分化和矿化产影响进一步影响牙轮发育。     

四种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞表达核心结合因子a1的研究

目的：探讨4种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞中核心结合因子a1（core binding factor al，cbfal）表达的影响。方法：体外培养人牙乳头细胞，转染pcDNA3-cbfal重组质粒，G418筛选建立稳定表达cbfal的细胞模型PC-3，分别在正常细胞和PC-3细胞中加入不同浓度的BMP-2、TGF-β1、FGF-2、EGF，采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学的方法，观察这4种生长因子在人牙乳头细胞中对cbfal基因表达、蛋白合成、蛋白表达部位的影响。结果：200ng／mLBMP-2和50ng／mL的FGF-2刺激正常人牙乳头细胞6h后cbfal的表达明显升高，而20和40ng／mL的TGF-β1作用12h，能抑制稳定转染cbfal基因的细胞中cbfal mRNA的表达；EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。结论：BMP-2和FGF-2可以上调人牙乳头细胞中cbfal的表达，TGF-β1对cbfal的表达有抑制作用，EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。     

低氧对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的 研究低氧对人牙囊细胞（hDFCs）生物学特性的影响。方法 利用组织块酶消化法从年轻恒牙中分离培养hDFCs;采用免疫荧光技术检测细胞表面标志物,多向诱导实验检测细胞多向分化潜能;模拟体外低氧微环境,将细胞分为常氧组（20%O₂）和低氧组（2%O₂）,分别对两组细胞行Transwell小室试验检测低氧对细胞迁移的影响,采用CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分别从基因和蛋白水平检测hDFCs多能性相关标志物于不同氧体积分数下的表达;分别对两组细胞进行成骨诱导,qRT-PCR检测成骨相关基因,茜素红染色评估矿化结节的形成。结果 hDFCs具有较强的干细胞特征,具有成骨、成脂及成神经多向分化能力,符合间充质干细胞基本标准,能够满足牙组织工程构建对种子细胞的需求。低氧有利于hDFCs多能性的保持,同时促进了hDFCs的迁移和增殖。hDFCs于低氧中进行诱导时,其成骨分化能力得到增强。结论 低氧微环境对维持hDFCs多能性,促进hDFCs增殖、迁移和分化有重要作用。     

IGF-1对小鼠牙囊细胞生物学特性的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对小鼠牙囊细胞增殖、蛋白含量及分化能力影响。方法:将第3代小鼠牙囊细胞与不同浓度IGF-1(0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L)共孵育后,测定IGF-1对细胞增殖、碱性磷酸酶活性、总蛋白含量的影响;并用Von Kossa法检测0.05和0.1 mg/L的IGF-1对牙囊细胞矿化结节形成能力的影响。结果:在0.05~0.1 mg/L的浓度范围内,IGF-1能显著促进牙囊细胞的增殖,使ALP活性及总蛋白含量增加(P<0.01),但三者的最佳效应浓度有所差异,当浓度升高至0.5 mg/L时,促进效应下降,与对照组无显著性差异(P>0.05);0.05和0.1 mg/L的IGF-1均能显著促进牙囊细胞矿化结节的形成(P<0.05,与对照组相比)。结论:合适浓度的IGF-1能促进牙囊细胞的增殖,增加蛋白含量及向成骨细胞(成牙骨质细胞)方向分化的能力。     

大鼠牙囊细胞多向分化潜能的体外研究

目的:体外研究用差速贴壁法和有限稀释法纯化的大鼠牙囊细胞(Dental foilicle cells,DF-Cs)的多向分化潜能,为用于口腔组织工程的种子细胞奠定基础。方法:体式显微镜下准确分离7 d龄SD大鼠第一磨牙牙囊组织,使用酶消化法、有限稀释法、差速贴壁法进行培养和纯化细胞,取第3代细胞分别进行以下检测:①流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记;②骨向诱导、成脂诱导、成神经诱导和相关检测。结果:①差速贴壁法和有限稀释法纯化培养的大鼠牙囊细胞大多呈长梭形,部分细胞呈三角形,细胞形态呈现异质性;②流式细胞仪检测结果显示所获得的牙囊干细胞表面标记CD29、CD90阳性率分别为95.6%、98.6%,而CD45的阳性率仅为4.2%;③成骨诱导后,茜素红染色呈阳性,ALP染色显示ALP表达增强明显;成脂诱导后细胞胞浆内可见明显脂滴,油红O染色呈阳性;神经细胞诱导后细胞形态发生明显改变,神经微管蛋白染色呈阳性。结论:体外培养的大鼠牙囊细胞具有较强的多向分化能力,可作为口腔组织工程理想的种子细胞。     

牙囊和上皮根鞘细胞成无细胞牙骨质的机制

无细胞牙骨质是锚定牙周纤维和牙根的重要组织结构,牙囊细胞（DFC）通过自身分化和上皮根鞘（ERS）通过上皮-间质转化（EMT）形成的成牙骨质细胞参与无细胞牙骨质形成。牙囊细胞体外移植后可形成纤维样和牙骨质样组织,而牙乳头和上皮根鞘可以诱导牙囊细胞从基因及其蛋白质水平高表达碱性磷酸酶、骨涎蛋白等无细胞牙骨质相关标志物。其中钙离子、骨形态发生蛋白、Wnt／β-连环蛋白通路等目前被认为是介导牙囊细胞成牙骨质分化的信号转导通路。目前发现,调控无机磷酸盐胞内外浓度的转运蛋白对无细胞牙骨质形成调节的敏感性更高。ERS亦可通过EMT形成间质细胞来参与牙周组织的发生。钙结合蛋白D28k、末端较小的同源异形盒-2等在无细胞牙骨质、ERS以及牙囊细胞表达差异都说明了ERS具有成牙骨质细胞特性。在此过程中,TGFβ激活下游蜗牛蛋白后,通过磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B信号转导通路来介导ERS的无细胞牙骨质分化过程。