TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用

目的 探讨Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用.方法 取14只SD大鼠为供体,28只Wistar大鼠为受体,建立28个同种异体穿透性角膜移植模型.建模后分为同种异体角膜移植组14只(6只用于术后观察排斥情况),同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组14只(6只用于术后观察排斥情况).另选16只Wistar大鼠,分为同种自体角膜移植组8只,正常对照组8只.3个手术组大鼠分别行穿透性角膜移植术.术后TLR2单克隆抗体组给予0.5 g·L-1TLR2单克隆抗体,分别于术后0d、2d、4d、6d、8d分5次经球结膜下注射给药.正常对照组、同种自体角膜移植组及同种异体角膜移植组给等量生理盐水.术后每天于裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管,并用排斥反应指数评分.第9天取材,行HE、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测.结果 术后随时间变化各手术组角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊和新生血管生长,以同种异体角膜移植组最为明显.HE染色结果显示在同种异体角膜移植组,角膜基质层出现水肿、大量炎症细胞浸润和新生血管,而在同种自体角膜移植组和TLR2单克隆抗体组中炎症反应较轻.免疫组织化学检测结果:TLR2和MyD88分子在正常对照组、同种自体角膜移植组及TLR2单克隆抗体组的角膜上皮中均有微量表达,同种异体角膜移植组角膜上皮、基质细胞中TLR2和MyD88分子的表达明显增多,尤以基质层明显.实时荧光定量PCR结果显示同种异体角膜移植组角膜组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA的表达较同种自体角膜移植组(P =0.000、0.004)和正常对照组(P=0.000、0.000)显著增加,两者的表达亦较TLR2单克隆抗体组显著增加(P =0.000、0.003).结论 TLR2单克隆抗体抑制TLR2及其下游信号分子MyD88的表达;TLR2/MyD88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,影响了角膜植片的转归.     

ResolvinE1对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用

背景 以往防治角膜移植术后排斥反应的药物存在诱发局部或全身不良反应的风险,研究表明resolvinE1(RyE1)能够调节辅助性T细胞1(Th1)型免疫反应,但其对高危角膜移植术后的植片排斥反应有无抑制作用尚不清楚. 目的 观察高危角膜移植动物模型局部应用RvE1对植片免疫排斥反应的抑制作用.方法 以BALB/c小鼠为受体、C57BL/6小鼠为供体行角膜移植术.采用随机数字表法将90只BALB/c小鼠随机分成异体角膜移植组、异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,每组各30只.BALB/c小鼠右眼先用缝线法刺激2周以建立高危角膜移植眼模型,然后行穿透角膜移植术.异体角膜移植组和异体角膜移植+RvE1组小鼠右眼行异体角膜移植,自体角膜移植组小鼠将右眼角膜植片旋转180°后缝合于植床上.异体角膜移植组及自体角膜移植组小鼠术后每日用生理盐水10μl结膜下注射1次,异体角膜移植+RvE1组小鼠术后同法注射终质量浓度为0.1 μg/μl的RvE1 10μl,连续7d.术后裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜植片反应并对其排斥反应进行评分.术后21 d处死各组小鼠各20只,收集小鼠术眼角膜、眼球和术眼侧颈部淋巴结,采用苏木精-伊红染色法观察各组小鼠角膜植片的组织病理学变化;采用免疫组织化学法检测术眼角膜中CD4及γ干扰素(IFN-γ)的表达;采用流式细胞术检测术眼侧颈部淋巴结淋巴细胞中Th1细胞(CD3+ CD8a-IFN-γ+)比例;采用荧光定量PCR法检测Th1细胞相关因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-c)、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达水平.结果 异体角膜移植+RvE1组小鼠角膜植片存活时间为(28.5±1.7)d,明显长于异体角膜移植组的(14.0±1.6)d,差异有统计学意义(t=4.14,P＜0.001),自体角膜移植组小鼠植片在术后50 d存活率为100％.苏木精-伊红染色显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠角膜植片水肿及炎性细胞浸润程度均轻于异体角膜移植组.免疫组织化学法检测显示,各组角膜全层均有CD4表达,而IFN-γ主要表达于角膜上皮层,异体角膜移植组小鼠角膜组织中CD4和IFN-γ阳性细胞数均明显多于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组.流式细胞术检测显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠淋巴细胞中Th1细胞比例分别为(1.07±0.25)％和(0.85±0.12)％,明显低于异体角膜移植组的(1.56±0.20)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).荧光定量PCR检测显示,异体角膜移植组小鼠角膜中IL-2、TNF-α、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达量明显高于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 RvE1可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应,作用机制可能与其下调角膜植片和淋巴细胞中Th1细胞及相关细胞因子的表达有关.     

CD4和CD8基因敲除鼠行穿透性角膜移植术后免疫排斥特征的研究

目的　探讨CD4和CD8基因敲除小鼠行穿透性角膜移植术后免疫排斥反应发生的机制。方法　CD4、CD8基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠各20只,分成3组,右眼接受穿透性角膜移植术,供体为BALB/c小鼠,术后裂隙灯显微镜评价角膜移植片情况,并详细记录免疫排斥的发生时间,在术后1、2、4周各取2只鼠术眼行免疫组织化学检查,观察眼前段CD+4 、CD+8 T细胞的变化。在术后2周, 3组小鼠各选其中10只接受皮肤移植,供体为BALB/c小鼠,监测皮肤移植后皮肤植片免疫排斥反应的时间和在皮肤发生排斥反应时角膜移植片的情况。结果　3组小鼠角膜移植术后免疫排斥发生时间明显不同,CD4基因敲除鼠角膜移植片保持透明,至少观察了90d未见免疫排斥反应发生;CD8基因敲除小鼠在(28±3)d时发生免疫排斥反应;C57BL/6小鼠发生免疫排斥反应的时间为(14±2)d(F=2034, P<0. 01)。移植皮肤后发生免疫排斥反应时间为:CD4基因敲除鼠(14±2)d,CD8基因敲除鼠(12±1)d,C57BL/6小鼠(10±1)d(F=42. 54, P<0. 01)。结论　小鼠行穿透性角膜移植术后免疫排斥反应可能是以T淋巴细胞,主要为CD+4 T细胞介导的免疫排斥反应,CD+8 T细胞参与了排斥反应过程。     

小分子化合物J2对小鼠角膜移植术后植片RANTES基因表达的影响

[摘要]目的研究小分子化合物J2对同种异基因小鼠角膜移植后植片RANTES基因表达的影响，从而探讨新型药物J2对于角膜移植排斥反应的作用机制。方法建立小鼠角膜移植模型，随机分为A、B、C、D四组。A组为自体原位移植组，B、C、D组均采用C57BL／6-BALB／c同种异体角膜移植模型，术后采用腹腔注射给药，自手术当日开始，A组、B组给予安慰剂，C组给予CsA10mg／kg，D组给予J215mg／kg，每天1次，连续给药12d。观察各组植片生存指数变化，分别在术后第1周、第2周、第3周、第4周行RT-PCR检测角膜植片中RANTES基因的表达。结果同种异体移植安慰剂组角膜植片平均存活时间为（18.87±4，19）d，J2组和CsA组发生排斥时间明显延迟，分别为（33.12±6.80）d和（35.13±5.74）d，与同种异体移植安慰荆组比较差异有显著性（P〈0.01），但J2组与CsA组比较差异无显著性。在正常小鼠角膜未见RANTES基因表达。自体移植组RANTES基因在第1周均有少量表达，而其他3周没有显著表达；异基因移植组从第1周开始表达各种基因，第3周表达明显增强；而CsA组和J2组从第1周开始表达，第2、第3周表达减弱，第4周表达强于前3周。结论RANTES基因参与了异基因小鼠角膜移植排斥反应，J2可以抑制其表达。     

B7-H3在小鼠角膜移植免疫赦免中的作用探讨

目的 探讨共刺激分子B7-H3在小鼠角膜中的表达情况以及在角膜移植免疫赦免中的作用.方法 实验研究.以C57BL/6小鼠为供体、BALB/c小鼠为受体建立角膜移植实验模型,采用简单随机抽样方法,取8只未行角膜移植的BALB/c小鼠作为正常对照组,另取8只BALB/c小鼠作为自体角膜移植组,最后30只BALB/c小鼠进行同种异体角膜移植;按Sonoda法观察小鼠角膜移植后的存活率,8周内植片混浊评分≥2分判定为排斥组,8周时未达到2分的认为是存活组;各组各取3只眼球,HE染色后行组织病理学观察并行B7-H3分子的免疫组织化学检测;各组各取5只眼角膜,行荧光定量PCR检测B7-H3分子mRNA的表达情况.各组角膜组织中的B7-H3 mRNA表达差异倍数比较采用设计单因素的方差分析,组间的多重比较采用LSD-t检验.结果 同种异体角膜移植组并未完全排斥,30只小鼠中有9只存活,21只排斥,移植存活率为30％;自体角膜移植组移植存活率为100％;免疫组织化学表明B7-H3分子在正常对照组和自体角膜移植组的角膜上皮、内皮细胞和虹膜睫状体中均有表达,在存活组中的表达明显增加,而在排斥组中的表达明显减少;qPCR检测在正常对照组(4.30±0.023)和自体角膜移植组(4.33±0.031)中均可以检测出B7-H3分子mRNA的表达;同种异体角膜移植排斥组B7-H3分子的mRNA表达程度(3.89±0.037)明显下降;但在同种异体角膜移植存活组中B7-H3分子的mRNA表达(5.04±0.058)明显增加;将各组B7-H3 mRNA的表达差异进行统计学分析,先进行方差齐性检验(F =429.546),再采用LSD法进行两两比较,除了正常对照组与自体角膜移植组之间差异无统计学意义(P =0.387)之外,正常对照组与存活组及排斥组比较,差异均有统计学意义(P =0.001,0.003)结论 B7-H3分子在促进角膜移植的免疫赦免中发挥一定的作用,可能是维持移植角膜免疫耐受状态的重要因子之一.     

小鼠角膜移植排斥反应中植片内细胞因子表达水平的变化

背景研究表明细胞因子在角膜移植免疫调节中起重要的作用,但关于角膜移植术后角膜植片内细胞因子表达的变化报道较少。目的探讨角膜移植术后不同时间点细胞因子的表达变化。方法采用雌性6～8周龄BALB／c小鼠及C57BL／6小鼠分别建立小鼠自体角膜移植和同种异体角膜移植模型,每组各10只,自体角膜移植术组供体和受体同为BALB／c小鼠,同种异体角膜移植术组供体为C57BL／6小鼠,受体为BALB／c小鼠。于术后1d开始临床观察角膜植片并对炎症程度进行评分,当植片评分总和≥5分或植片混浊≥2分时为发生植片排斥反应。将BALB／c小鼠随机分为正常对照组3只和同种异体角膜移植术组15只,后者分别于术后6h及1、3、7、14d对角膜植片行逆转录PCR（RT—PCR）检测植片中细胞因子白细胞介素4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ）、IL-10、肿瘤坏死因子α（TNF—α）表达的变化。结果在60d的观察期中,自体角膜移植术后小鼠角膜植片混浊评分均〈2分,植片的炎症评分之和均〈5分,植片存活率为100％,但同种异体角膜移植术后角膜植片水肿、混浊,伴有角膜新生血管形成,至术后24d角膜植片排斥反应评分之和均≥5分,植片混浊评分≥2分,全部发生排斥反应,角膜植片平均存活时间为（17．80±4．66）d。RT—PCR检测结果表明,正常角膜中IL-4和IFN-γ呈阳性表达,IL-10和TNF-α表达阴性。同种异体角膜移植术后6h可检测到IL-4呈阳性表达,IFN-γ和IL-10表达呈强阳性,而未检测到TNF—α的表达。术后1～3d角膜植片中IL-4呈强阳性表达,IFN-γ阳性表达,TNF—α表达增强,IL-10表达逐渐消失。角膜移植术后7d,可见IL-4表达阴性,而IFN-γ、IL-10和TNF—α仍呈强阳性表达。至术后14d,角膜植片中IL-4、IFN-γ和TNF—α．均未见表达,仅检测到IL-10呈阳性表达。结论TNF-α是角膜移植术后局部参与调控的主要因子。     

共刺激分子Tim-1在角膜移植排斥反应中的作用

背景 角膜移植是目前临床上治疗角膜盲可靠且有效的复明手段,角膜移植术后的免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原因. 目的 研究共刺激分子Tim-1在大鼠角膜组织中的表达及其在角膜移植排斥反应发生和发展过程中的作用.方法 40只清洁级成年雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组、自体角膜移植组和同种异体角膜移植组.正常对照组大鼠未行任何手术,自体角膜移植组分别以Wistar大鼠作为供体和受体施行穿透角膜移植术,而同种异体角膜移植组以SD大鼠角膜作为供体,Wistar大鼠作为受体行穿透角膜移植术,各组供体角膜植片均为3.5mm,植床直径为3.0 mm.分别于术后7d、14d在裂隙灯显微镜下观察术眼角膜炎症反应情况,按照Larkin的标准进行排斥反应评分,计算排斥反应指数（RI）,观察各组角膜植片的平均存活时间和植片存活率.术后7d、14d,3个组各取3只大鼠眼球制备角膜组织切片,分别行组织病理学检查和免疫组织化学检测,观察角膜组织的炎症反应和共刺激分子Tim-1蛋白在角膜组织中的表达;此外分别于术后7d、14d各组取5只大鼠角膜制备组织匀浆,采用实时荧光定量PCR法检测共刺激分子Tim-1 mRNA在大鼠角膜植片中表达量（吸光度,A）的变化.结果 术后7d,自体角膜移植组和同种异体角膜移植组大鼠角膜植片均出现轻度水肿;术后14 d,自体角膜移植组角膜植片水肿消失,植片透明,而同种异体角膜移植组大鼠角膜植片水肿增厚,呈灰白色混浊,可见新生血管形成.自体角膜移植组植片的存活率为100％,同种异体角膜移植组植片存活率为0,平均生存时间为（9.8±1.2）d.组织病理学检查表明,术后7d自体角膜移植组植片基质层可见炎性细胞浸润,但术后14d炎性细胞明显减少;同种异体角膜移植组术后7d植片水肿,基质层可见炎性细胞浸润,术后14 d阳性细胞大量增加,可见新生血管.免疫?     

糖皮质激素对角膜移植术后大鼠角膜TLR2表达的影响

目的检测大鼠角膜组织TLR2mRNA的表达,研究糖皮质激素对穿透角膜移植术后角膜TLR2表达的影响及对术后排斥反应的作用。方法实验动物分正常对照组（N）、同种同体角膜移植组（A）、同种异体角膜移植组（B）和同种异体角膜移植激素（典必殊滴眼液点术眼,每日2次）抗排斥组（C）,A、B、C3组大鼠给予穿透角膜移植术,术后裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管并用排斥反应指数评价;分别于术后第5、7、9天取材,行组织病理学检查和实时荧光定量PCR检测,动态观察角膜组织中TLR2mRNA的表达。结果术后随时间变化角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊、新生血管生长。B组大鼠平均在穿透角膜移植术后7d发生排斥反应并获病理学支持;A组和C组大鼠术后排斥反应指数计分未达到诊断标准。术后3组手术干预组角膜TLR2mRNA的表达均增加,同种异体角膜移植组角膜TLR2mRNA的表达较同种同体角膜移植组显著增加,激素抗排斥组角膜TLR2mRNA表达明显降低（P〈0.05）。结论糖皮质激素可能通过抑制角膜TLR2的表达及其介导的信号转导,抑制排斥反应,对移植物起保护作用。     

TLRs在大鼠穿透角膜移植术后排斥反应中的作用

目的动态检测大鼠角膜组织TLR2、TLR3、TLR4mRNA的表达,研究TLR2、TLR3、TLR4在穿透角膜移植术后免疫排斥反应中的作用。方法采用SPF级雌性SD大鼠108只为受体,SPF级Wistar大鼠36只为供体,另取SPF级雌性SD大鼠6只12只眼为正常对照组。受体大鼠分为3组：自体角膜移植组（A）、同种异体角膜移植组（B）和同种异体角膜移植后糖皮质激素应用组（C）,A、B、C组各36只大鼠接受穿透角膜移植术,术后裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管情况并采用排斥反应指数（RI）进行评分。分别于术后第5、7、9天获取角膜标本行组织病理学检查和荧光实时定量PCR（real-timePCR）检测,动态观察角膜组织中TLR2、TLR3、TLR4mRNA的表达。结果术后随时间变化,A、B、C组大鼠角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊、新生血管生长。B组大鼠角膜RI平均在术后7d符合排斥反应的诊断标准并经病理学检查证实。A组和C组大鼠角膜的RI计分未达到排斥反应诊断标准。正常大鼠角膜可见TLR2、TLR3、TLR4mRNA表达;术后9dB组大鼠角膜TLR2mRNA的表达较A组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.05）;TLR3mRNA和TLR4mRNA在B组各时间点间表达的差异倍数比较均无统计学意义（P=0.30;P=0.32）,但组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 TLR2可能作为天然免疫识别受体识别移植抗原,参与角膜移植术后的免疫排斥反应。     

小分子化合物J2抑制小鼠角膜移植术后排斥反应的研究

目的 探讨新型药物J2抗同种异基因小鼠角膜移植术后排斥反应的作用及其机制.方法 实验研究.采用随机分组设计的研究方法.建立以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体的角膜移植实验模型,其中供体38只,受体100只,随机分为A、B、C、D 四组,每组25只.A组为BALB/c小鼠白体原位角膜移植,B、C及D组均采用C57BL/6-BALB/c同种异体角膜移植,术后采用腹腔注射给药,自手术当日开始,A组、B组给予安慰剂,C组给予CsA 10 mg/kg体重,D组给予J215 mg/kg体重,每天1次,连续给药12 d.观察各组植片生存指数变化,苏木素-伊红染色及冰冻切片免疫组织化学观察角膜植片病理改变;分别在术后1、2、3及4周行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测角膜植片中细胞因子的表达.各组间植片存活时间差异采用One-Way ANOVO分析进行比较,两组之间比较采用SNK法.结果 B组角膜植片平均存活时间为(18.88±4.19)d,D组发生排斥时间明显延迟为(33.62±6.S0)d,两组比较差异有统计学意义(q=8.33,P=0.00),而D组与C组比较差异无统计学意义(q=0.85,P=0.60).组织学检查证实,术后21 d,B组见大量细胞浸润,而D组与C组植片未见明显的细胞浸润.免疫组织化学检测显示安慰剂组角膜植片大量CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润,J2组与CsA组植片仅有少量的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润.RT-PCR结果显示,在正常小鼠角膜未见IL-10和IFN-γ基因表达;异基因移植组从第1周开始表达各种基因,第3周表达明显增强;而J2组与CsA组从第1周开始表达,第2、3周表达减弱,第4周表达强于前3周.结论 J2通过拮抗CD4与主要组织相容性抗原(MHC)Ⅱ分子结合抑制CD4+T淋巴细胞激活,从而具有抗小鼠角膜移植排斥作用.     

甲状腺相关眼病患者血清中Th1 Th2型细胞因子平衡偏离的研究

目的 探讨血清中Th1、Th2型细胞因子平衡偏离与甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)发病、活动性及大剂量糖皮质激素治疗反应的关系.方法 选取TAO患者52例,按CAS评分标准将其分为活动期29例(CAS≥4)和非活动期23例(CAS＜4).其中活动期患者中有22例给予大剂量糖皮质激素治疗;另外选取初诊Graves病患者15例及正常对照15例,收集上述人静脉血,行激素冲击治疗的患者于冲击前后各抽血1次.采用放射免疫法检测血清中IL-4浓度,ELISA法检测IFN γ浓度.比较活动期与非活动期TAO组、GD组以及正常对照组血清上述指标的变化;评价糖皮质激素治疗对上述指标的影响.结果 ①TAO及GD患者血清中IL-4、IFNγ浓度均较对照组明显增高.②活动期TAO与非活动期TAO相比血清中IL-4、IFN7浓度无明显统计学差异,但活动期IL-4/IFN γ比值较非活动期降低,有统计学差异.③22例激素冲击治疗患者中15例有效(CAS减少≥2),7例无效(CAS减少＜2),有效组治疗后血清中IFN γ浓度明显较治疗前降低,IL-4/IFNγ比值增高,而无效组未见明显变化.结论 Th1/Th2在一定程度可以作为TAO活动性判断指标之一,活动期TAO Th2/Th1比值下降,非活动期无明显变化.在一定程度还可以作为大剂量糖皮质激素治疗疗效的判断指标之一,有效者Th2/Th1比值上升,向Th2偏移,无效者治疗前后无明显改变.     

Th1、Th2和Th17型细胞因子水平与糖尿病视网膜病变的相关性研究进展

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是目前主要的致盲眼病,其发病机制复杂且尚未明确,近年发现免疫炎症反应和细胞因子在其发病中起重要作用。Th1、Th2、Th17型细胞因子在DR中分泌异常,作用并影响了疾病的发生发展。本文就Th1、Th2、Th17型细胞因子与DR的相关性研究进展作一综述。     

糖皮质激素对葡萄膜炎患者外周血Th1和Th2细胞因子的影响

目的探讨糖皮质激素治疗前后葡萄膜炎患者外周血单核细胞（PBMC）培养上清液Th1/Th2细胞因子的变化。方法应用酶联免疫吸附试验检测治疗前后葡萄膜炎患者PBMC上清液干扰素（IFN-γ）、白介素（IL）-2、IL-4和IL-10水平的变化,30例健康人作为正常对照。结果急性葡萄膜炎患者PBMC上清液IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平与IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10比值明显高于恢复期患者和正常对照者（P=0.000）。糖皮质激素治疗后,IFN-γ和IL-2水平、IFN-γ/IL-4和IFN-γ/IL-10比值降低（P=0.000）,IL-10水平升高（P=0.000）。治疗前不同类型葡萄膜炎组仅IFN-γ和IL-10水平差异有统计学意义（P〈0.01）,治疗后IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ/IL-10比值差异有统计学意义（P〈0.05）。治疗前后前葡萄膜炎和Vogt-小柳原田病患者除IL-4外,其余细胞因子及比值差异均有统计学意义（P〈0.05）;Behcet病患者除IL-4和IL-10外,其余细胞因子及比值差异均有统计学意义（P〈0.01）。治疗前后葡萄膜炎患者IFN-γ与IL-2水平间及IL-4与IL-10水平间呈正相关（P=0.000）。结论急性葡萄膜炎患者PBMC中Th1细胞因子显著升高并占优势,表明Th1/Th2细胞因子不平衡性与葡萄膜炎的发病有关。     

Th1/Th2细胞因子在小鼠真菌性角膜炎中的表达

目的 通过检测Th1/Th2细胞因子在小鼠真菌性角膜炎中的表达水平,探讨机体免疫在该病发展中的作用. 方法应用角膜表层镜法建立Balb/c小鼠茄病镰刀菌性角膜炎模型,在感染后第1、3、5、7天,裂隙灯显微镜观察角膜炎特点;HE染色观察角膜病理变化;半定量RT-PCR和ELISA检测角膜中Thl细胞因子(IFN-γL-12)及Th2细胞因子(IL-4、IL-10)基因mRNA和蛋白的表达,半定量RT-PCR检测T-bet基因mRNA的表达;直线相关分析检测T-bet mRNA与IFN-比值的相关性. 结果角膜接种菌液后,早期角膜浸润混浊进行性加重,第5天后新生血管大量生长;HE染色可见第1、3天在角膜缘、角膜基质及前房中有大量的炎症细胞浸润,第5天后炎症细胞减少,角膜基质中纤维细胞逐渐增多;RT-PCR与ELISA检测结果表明,Thl细胞因子(IFN-γL-12)和Th2细胞因子(IL-4、IL-10)基因mRNA及蛋白在角膜接种菌液后均出现表达,且IFN-γL-12的表达显著强于IL-4、IL-10;IFN-γ/IL-4比值在第3天达最高值,而后逐渐降低;T-bet mRNA在第3天达最高值;T-bet mRNA的表达与IFN-γ/IL-4比值呈正相关(P＜0.05). 结论在真菌性角膜炎中,Thl/Th2型免疫应答共同参与调节机体的抗真菌免疫,但以Th1型应答为主;角膜感染真菌后第3天机体的免疫力达最强.     

Th1 polarization of the immune response in uveitis in Behçet's disease

BACKGROUND: It has been reported that abnormalities in the balance of T-helper cells type 1/2 (Th1/Th2) may account for the pathophysiology of human autoimmune diseases. The purpose of this study was to define the role of the Th1/Th2 balance in the pathogenesis of uveitis in Beh?et's disease (BD). METHODS: From February 2003 to August 2005, we studied 31 patients with active BD. Of these patients, 21 (12 female, 9 male; mean age 35.5 [SD 10] years) presented with acute uveitis, and 10 (7 female, 3 male; mean age 34 [SD 11] years) presented with inflammatory arthritis but no prior uveitis attack. The control group consisted of 10 (7 female, 3 male; mean age 34.7 [SD 8] years) age-matched, healthy individuals. CD4+ CD26+ and CD4+ CD30+ cell surface expression of the peripheral blood CD4+ T lymphocytes was evaluated by analytic flow cytometry in order to determine percentages of Th1 and Th2 lymphocyte subsets. RESULTS: The mean percentage of CD4+ CD26+ and CD4+ CD30+ cells was 26.27 (SD 6.18) % and 2.56 (SD 0.82) %, 17.42 (SD 5.90) % and 2.86 (SD 0.72) %, and 14.99 (SD 3.96) % and 3.11 (SD 1.25) % in BD with active uveitis, BD with inflammatory arthritis but no prior uveitis attack, and control groups, respectively. T-helper 1 (Th1) cell percentage was significantly higher in the BD with active uveitis group than the BD with arthritis and no prior uveitis attack group (p = 0.001). With respect to the percentage of CD30+ Th2 cells, there was no statistical difference between the 2 BD groups (p = 0.529) or among the 3 groups (p = 0.375). INTERPRETATION: Th1 lymphocyte dominance in peripheral circulating blood may play a role in the pathogenesis of BD uveitis.     

复发性病毒性角膜炎外周血T细胞的变化

目的：研究复发性病毒性角膜炎患者外周血T淋巴细胞亚群、T细胞激活状态及Th1／Th2模式，进一步探讨其免疫发病机制。方法：运用流式细胞仪检测30例复发性病毒性角膜炎患者血浆TH1（IFN-γ，TNF-α，IL-2），TH2（IL-10，IL-5，IL-4）细胞因子水平以及外周血淋巴细胞CD3^＋，CD4^＋，CD8^＋T细胞和CD3^＋HLA-DR^＋，CD4^＋HLA-DR^＋，CD8^＋HLA-DR^＋T细胞百分率，并与健康对照组比较。结果：复发性病毒性角膜炎患者血浆IFN-γ，IL-2水平有明显上升（P〈0．05）；IL-4水平下降（P〈0．05）。CD4^＋细胞下降（P〈0．05）；CD4^＋HLA-DR可及CD8^＋HLA-DR^＋T可细胞上升（P〈0．05）。结论：复发性病毒性角膜炎患者T细胞过度活化和TH1／Th2平衡的偏离；Th1激活增强，Th2激活减弱与病毒性角膜炎的复发、迁延有关。     

Rapamycin ameliorates experimental autoimmune uveoretinitis by inhibiting Th1/Th2/Th17 cells and upregulating CD4+CD25+ Foxp3 regulatory T cells

AIM:To determine the effects of rapamycin on experimental autoimmune uveoretinitis (EAU) and investigate of role of rapamycin on T cell subsets in the disease. METHODS:EAU was induced in rats using peptides 1169 to 1191 of the interphotoreceptor binding protein (IRBP). Rapamycin (0.2 mg/kg/d) was administrated by intraperitoneal injection for a consecutive 7d after immunization. Th1/Th2/Th17 cytokines, TGF-β1, and IL-6 produced by lymphocyteswere measured by ELISA, while Th17 cells and CD4+CD25+ regulatory T cells (Tregs) from rat spleen were detected by flow cytometry. RESULTS: Intraperitoneal treatment immediately after immunization dramatically ameliorated the clinical course of EAU. Clinical responses were associated with reduced retinal inflammatory cell infiltration and tissue destruction. Rapamycin induced suppression of Th1/Th2/Th17 cytokines, including IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-4, and IL-10 release from T lymphocytes of EAU rats, in vitro. Rapamycin also significantly increased TGF-β1 production but had no effect on IL-6 productionof T lymphocytes from EAU rats in vitro. Furthermore, rapamycin decreased the ratio of Th17 cells/CD4+T cells and upregulated Tregs in EAU, as detected by flow cytometry. CONCLUSION: Rapamycin effectively interferes with T cell mediated autoimmune uveitis by inhibiting antigen-specific T cell functions and enhancing Tregs in EAU. Rapamycin is a promising new alternative as an adjunct corticosteroid-sparing agent for treating uveitis.     

甲状腺相关眼病与Th1/Th2免疫平衡

背景 甲状腺相关眼病(GO)是自身免疫性疾病,目前其发病机制尚不清楚,近年来的研究发现Th1/Th2型免疫平衡反应的失调是导致GO的主要原因. 目的 采用脂质体包裹的人促甲状腺激素受体(hTSHR)胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠以建立GO动物模型,研究关于在GO小鼠模型血清Th 1/Th2型免疫反应平衡状态,探讨GO的病理机制.方法 采用计算机数字随机分配法将同系6～8周龄雌性BALB/c小鼠32只分为重组质粒注射组、空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组.重组质粒注射组分别于实验的0、3、6周采用脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.1 +/hTSHR289各30 μg行双胫前肌内注射,再于腹腔内注射40 μg以免疫小鼠,空质粒注射组和脂质体注射组分别采用pcDNA3.1+和脂质体以同样的方法进行免疫,空白对照组不做任何处理.分别于注射前及各次注射后第4天及第17周末处死小鼠行心脏采血,采用ELISA法检查各组小鼠血清中白细胞介素(IL)-2及IL-4质量浓度,计算IL-2/IL-4值.于初次免疫后17周末处死重组质粒注射组小鼠,取甲状腺及眼眶组织制作病理切片,采用苏木精-伊红染色法检测标本组织中炎性细胞浸润情况,对有炎性细胞浸润的标本进行免疫组织化学检测,计算B细胞特异标志物CD20阳性细胞(B)与T细胞特异标志物CD3ε阳性细胞(T)的比值,B∶T＞1.0者为Th2反应,相反者为Th1反应.结果 在第2次和第3次注射后,重组质粒注射组小鼠血清中IL-2质量浓度明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但组间小鼠血清IL-4质量浓度差异无统计学意义(P＞0.05);重组质粒注射组小鼠在第2次、第3次免疫后血清IL-2质量浓度明显低于免疫前及第1次免疫后,差异均有统计学意义(注射前:P=0.009、0.019;第1次注射后:P=0.002、0.004),而处死时小鼠血清IL-2质量浓度有所回升,明显高于第3次免疫后IL-2质量浓度[(44.31±1.77) pg/ml与(42.43±2.29) pg/ml],差异有统计学意义(P=0.031).空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组、重组质粒注射组第2次、第3次注射后血清IL-4质量浓度及IL4/IL2值均明显高于注射前和第1次注射后,其处死时重组质粒注射组小鼠血清IL-4质量浓度明显高于第3次注射后,差异均有统计学意义(均P＜0.05).处死时重组质粒注射组苏木精-伊红染色有炎性细胞浸润的7只小鼠12个眼眶标本中4个眼眶B∶T值＞1.0. 结论 采用脂质体包裹的TSH受体胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠可成功建立GO动物模型,重组质粒注射组小鼠在初次免疫后17周内以Th1型反应为主,小鼠第2次免疫后免疫平衡开始向Th2型转变.     

实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎中T-bet的表达及意义

目的 研究实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）中T-bet的表达及意义 方法 Lewis大鼠28只，用视网膜S抗原与Freund完全佐剂免疫24只大鼠以诱导EAU模型，另外4只作为正常对照。免疫组大鼠分别于免疫后7、12、15、21 d被处死，取所有大鼠的眼球和脾脏，固定后制作眼组织平片和眼球及脾脏的石蜡连续切片。使用单克隆抗T-bet 和CD4的抗体，通过免疫组织化学细菌蛋白过氧化物酶法在上述组织平片及切片上进行免疫组织化学单染和双染色，在光学显微镜下观察并计数阳性细胞，数据经SPSS 11.0统计学软件分析。 结果 正常眼和脾组织中均见少量T-bet阳性细胞；免疫后7 d，虹膜、视网膜及脾脏中T-bet的表达增加，免疫后15 d达高峰，免疫后21 d表达降低，但仍高于正常组。免疫组织化学双染色显示，T-bet阳性细胞中多数为CD4+。 结论 T-bet在EAU的发病中起着重要作用，其作用可能是通过激活辅助性T淋巴细胞1而实现的。（中华眼底病杂志，2004，20：172-174）     

Th1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠中的表达及作用

目的　探讨辅助性Ｔ细胞（Ｔｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓ,Ｔｈ）１、Ｔｈ１７细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｕｖｅｉｔｉｓ,ＥＡＵ）中的表达及作用。方法　取清洁级纯系健康雌性Ｌｅｗｉｓ大鼠４０只随机分为ＥＡＵ组（３２只）和对照组（８只）,ＥＡＵ组用光感受器间维生素Ａ类结合蛋白诱导大鼠ＥＡＵ模型,进行临床症状评分,免疫组织化学方法检测造模后视网膜内干扰素（ｉｎｆｅｒｆｅｒｏｎ,ＩＦＮ）-γ、诱导型一氧化氮合酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ,ｉＮＯＳ）、白细胞介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ,ＩＬ）-１７、ＩＬ-６的表达。ＥＬＩＳＡ法对比分析房水中各细胞因子的变化情况。结果　ＥＡＵ模型建立成功;造模后第１４天,视网膜损害以外层为主,视网膜内有大量炎细胞浸润,从而导致视网膜内结构紊乱,同时在视网膜的视锥、视杆细胞层和神经节细胞层ｉＮＯＳ、ＩＬ-１７、ＩＬ-６、ＩＦＮ-γ表达,细胞阳性率分别为２９％、４８％、５２％、７３％。在ＥＡＵ发病过程中,ＩＬ-６于造模后第７天迅速升高,第１０天达到高峰;ＩＬ-１７于造模后第１４天达到最高值,变化趋势与炎症进程一致;ＩＦＮ-γ在炎症后期仍有升高,于造模后第１６天达到最高值;ＩＬ-６、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γ与对照组相比,各时间点表达差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ｉＮＯＳ在炎症进程中表达有所增加,但与对照组相比,各时间点的表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。结论　Ｔｈ１、Ｔｈ１７细胞相关因子调节网络共同参与实验性自身免疫性葡萄膜炎的发生发展。