氧化应激诱导视网膜色素上皮细胞中钙蛋白酶激活作用研究

目的　观察一定浓度H₂O₂氧化应激体外培养人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE） 细胞中钙蛋白酶（Calpain）含量及细胞活性改变。方法　常规培养商品化人RPE细胞系ARPE-19作为对照组,培养基内加入终浓度为10 μmol·L^-1 及 100 μmol·L^-1的H₂O₂作为实验组,培养4 h、8 h、16 h及32 h进行测定。MTT法测定不同浓度H₂O₂刺激下RPE细胞不同检测时间点细胞增殖率的变化;Fluo-3/AM、ester钙离子荧光探针标记细胞内钙离子,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测RPE细胞内钙离子荧光值,间接观察钙离子浓度变化。10 μmol·L^-1 H₂O₂氧化刺激RPE细胞8 h,用Western-Blot法及实时荧光定量PCR法检测细胞内Calpain蛋白及RNA含量的变化。结果　与对照组相比,10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h、8 h、16 h及100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h及8 h后增殖率（r值） 升高差异均具有显著统计学意义（均为P<0.01）。100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激16 h及32 h细胞增殖率均较对照组下降（均为P<0.01）。10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞8 h后胞内钙离子荧光强度（563.27±77.10）U较对照组（170.77±20.11）U显著升高（P<0.01）、Calpain在mRNA和蛋白水平均较对照组显著升高（均为P<0.05）,而在同时使用Calpain抑制剂SNJ-1945（SNJ）的实验组这些变化可被有效抑制。结论　RPE细胞中钙超载激活Calpain参与H₂O₂氧化刺激RPE细胞的氧化应激改变。     

视网膜色素上皮细胞氧化应激相关microRNA的鉴定

目的：应用miRNA表达谱芯片筛选视网膜色素上皮细胞与氧化应激相关的miRNA,为更加全面深入地研究年龄相关性黄斑病变(age-related macular degeneration,AMD)发生的分子机制提供新的思路。

方法：培养D407细胞,分别使用100、200、400μmol/L H₂O₂处理细胞24h后,Trizol试剂抽提细胞总RNA,使用Exiqon miRCURY LNA^TM microRNA表达谱芯片(miRBase 16.0数据库)检测不同浓度处理后D407细胞miRNA的表达差异,并将不同浓度处理后的变化进行聚类分析。使用Stem loop realtime PCR对芯片结果进行验证,并运用生物信息学方法预测差异miRNA调控的靶基因。

结果：芯片所包含的1 425个已知miRNA中,共有367个在不同浓度H₂O₂处理后表达发生变化。通过Treeview软件进行聚类分析发现miR-31等17个miRNA随H₂O₂浓度的升高呈现逐渐降低的趋势,miR-206等7个则逐渐升高。PCR验证显示芯片结果准确性较好。

结论：H₂O₂作用前后RPE的miRNA表达存在明显差异,miRNA作为转录后水平的调节分子,参与了细胞氧化应激反应,可能在AMD的发生发展中起有重要作用。     

褪黑激素在视网膜色素上皮细胞氧化应激中对线粒体DNA保护作用的研究

目的研究褪黑激素(melatonin,MLT)在视网膜色素上皮(retinal pigment ep-ithelium,RPE)细胞体外氧化应激模型中对于线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的保护作用。方法利用过氧化氢(H2O2)诱导建立体外培养的人RPE细胞氧化应激模型,用不同浓度(0空白对照、0溶剂对照、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1和100μmol·L-1)和时间(即刻反应组、短期培养组1h和长期培养组2周)的MLT预处理,对模型中RPE细胞mtDNA的损伤规律进行测量和分析(RT-PCR法)。结果在即刻反应组和短期培养组中,模型中细胞mtDNA的损伤程度与MLT的浓度变化无相关性;但在长期培养组中2者显著相关(pearson相关分析:其中缺失性分析呈负相关r=-0.988,P=0.012;完整性分析呈正相关r=0.994,P=0.006)。结论在RPE细胞的氧化应激模型中,存在mtDNA的损伤改变;利用mtDNA分析可以有效评价细胞整体的氧化损伤状况;通过MLT的长期干预(2周)可以明显减轻mtDNA的氧化损伤程度。     

人视网膜色素上皮细胞NF-kB的表达

目的探讨核因子闎(NF-кB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrollidi ne dithiocarbamate,PDTC)、IL-1β对NF-кB表达的影响. 方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药(1)无PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在hRRE中的基础表达);(2)PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在PDTC预处理后hRPE中的表达).免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)测定上述2组标本中hRPE的NF-кB的表达率. 结果 NF-кB在hRPE中的基础表达率为8.05 %,IL-1β作用后表达率升高到30.26%; hRPE细胞经PDTC预处理后,NF-кB的表达率下降为3.74%,加入IL-1(10 υg·L-1)作用后表达率为3.66%. 结论 IL-1β可以显著提高NF-кB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NF-кB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL-1β诱导的NF-кB的活化过程.     

Tetramethylpyrazine在视网膜色素上皮细胞变性及脉络膜血流和RPE细胞氧化应激中的作用

目的:研究1%Tetramethylpyrazine(TMP)在视网膜色素上皮细胞(RPE)变性,脉络膜血流和RPE细胞氧化应激中的作用。方法:在碘酸钠诱导的大鼠RPE变性研究中,1%TMP滴眼液预先处理1wk,3次/d,1wk后予碘酸钠舌下静脉注射,在2wk和4wk末,视网膜电图(ERG)测量c波。色素微球体技术分析高眼压状态下TMP对脉络膜血流的影响。Methylthiazoltetrazolium(MTT)分析TMP在各种氧化应激中对RPE的保护作用。结果:碘酸钠注射后2wk,碘酸钠组ERG的c波下降至对照组的36%(P<0.01)。4wk后,碘酸钠组下降至对照组的46%(P<0.01),而1%TMP+碘酸钠组下降至对照组的77%(P<0.01)。与碘酸钠组比较,1%TMP+碘酸钠组控制了67%的c波下降(P<0.05)。在脉络膜血流的测量中,30,60,和120min的结果显示,TMP显著增加脉络膜血流。在氧化应激部分,不同浓度的TMP在各种氧化应激损伤中,对RPE都有各种程度的保护作用。结论:浓度为1%Tetramethylpyrazine可以显著保护碘酸钠和氧化应激诱导的RPE变性,增加脉络膜血流,并可能在AMD的治疗中发挥作用。     

Tetramethylpyrazine在视网膜色素上皮细胞变性及脉络膜血流和RPE细胞氧化应激中的作用

目的：研究1% Tetramethylpyrazine （TMP）在视网膜色素上皮细胞（RPE）变性,脉络膜血流和RPE细胞氧化应激中的作用.方法：在碘酸钠诱导的大鼠RPE变性研究中,1%TMP滴眼液预先处理1wk,3次/d,1wk后予碘酸钠舌下静脉注射,在2wk和4wk末,视网膜电图（ERG）测量c波.色素微球体技术分析高眼压状态下TMP对脉络膜血流的影响.Methylthiazoltetrazolium （MTT）分析TMP在各种氧化应激中对RPE的保护作用.结果：碘酸钠注射后2wk,碘酸钠组ERG的c波下降至对照组的36%（P〈0.01）.4wk后,碘酸钠组下降至对照组的46%（P〈0.01）,而1% TMP ＋碘酸钠组下降至对照组的77%（P〈0.01）.与碘酸钠组比较,1%TMP ＋碘酸钠组控制了67%的c波下降（P〈0.05）.在脉络膜血流的测量中,30,60,和120min的结果显示,TMP显著增加脉络膜血流.在氧化应激部分,不同浓度的TMP在各种氧化应激损伤中,对RPE都有各种程度的保护作用.结论：浓度为1% Tetramethylpyrazine可以显著保护碘酸钠和氧化应激诱导的RPE变性,增加脉络膜血流,并可能在AMD的治疗中发挥作用.     

Peroxiredoxin6在氧化损伤人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的 探讨Peroxiredoxin 6(Prx6)在体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达情况,以及在人RPE细胞受到不同浓度的H2O2攻击时Prx6表达量的变化.方法 复苏培养人RPE细胞传至第3代,实验分为正常对照组和不同浓度H2O2攻击组(0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1),加入H2O2,后24 h收集细胞.通过免疫组织化学和RT-PCR法检测各组细胞Prx6的表达情况,同时应用MTT法检测各组细胞的存活率.结果 免疫组织化学和RT-PCR结果显示培养的正常RPE细胞中即有Prx6的表达.0.125 mmol·L-1.H2O2攻击组Prx6阳性表达量较正常组增多(4倍),0.25 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1H2O2,攻击组Prx6阳性表达量逐渐减少,1 mmol·L-1H2O2攻击组Prx6表达为阴性.MTT结果显示在H2O2浓度为0.125 mmol·L-1时,细胞的存活率仅轻微下降(91%),与正常组相比无统计学意义(P=0.086);在浓度为0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1时,细胞的存活率明显下降,分别为83%、74%和52%,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 适量的氧化攻击可以诱导RPE细胞Prx6表达增高,进而保护细胞免受氧化损伤.     

视网膜色素上皮细胞相关细胞因子

很多眼底疾病与视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞功能改变有关。近期大量研究表明RPE细胞功能异常及分泌多种细胞因子参与这些疾病。检测这些细胞因子可反映RPE细胞的功能状态。对RPE参与的多种眼底疾病的研究和治疗提供了新的思路和手段     

白介素2α受体在人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的 研究白介素2α受体（IL-2Rα）在人视网膜色素上皮（RPE）细胞中的表达及白介素2（IL-2）对RPE细胞增生的影响。方法收集培养的2～4代的人胚胎RPE细胞，应用RT-PCR技术，用IL-2α受体特异引物对IL-2α受体进行检测，应用荧光激活细胞分类技术检测IL-2的结合。用抗CD25抗体的免疫荧光染色法识别IL-2α受体的表达，通过^3H摄取技术评估重组IL-2对RPE细胞增生的影响。结果 RPE细胞可表达IL-2Rα mRNA，免疫荧光染色和IL-2结合试验也可表明IL-2α受体的表达，高浓度的IL-2可诱导RPE细胞的增生（P〈0．05）。结论 培养的RPE细胞能够表达IL-2α受体，重组IL-2可促进RPE细胞的增生。     

艾塞那肽对4-羟基壬烯醛诱导人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用

目的观察艾塞那肽(exendin-4,EX4)对4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化应激损伤的抑制作用。方法体外培养人RPE细胞(ARPE-19),采用CCK-8法检测不同浓度EX-4处理后细胞增殖情况;利用倒置显微镜观察对照组、EX4处理组、4-HNE组和4-HNE+EX4处理组细胞形态变化;利用荧光显微镜观察各组细胞的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成;运用流式细胞仪检测各组RPE细胞内ROS含量变化;化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化。结果 100.0 nmol·L^-1 EX4对RPE细胞具有较强的保护作用,在此浓度下对10μmol·L^-1 4-HNE引起的氧化应激损伤具有较强的抑制作用(P<0.05)。荧光显微镜观察发现,与对照组相比,4-HNE组亮绿色高荧光信号...     

Metallothionein protects retinal pigment epithelial cells against apoptosis and oxidative stress

The retina expresses metallothionein (MT) which has been reported to protect cells against oxidative stress and apoptosis. The types of MT expressed by human retinal cells were identified by laser capture microdissection and RT--PCR and it was found that MT-2a is expressed by retinal pigment epithelial (RPE) cells, photoreceptor cells, inner nuclear layer cells and ganglion cells while MT-1a is expressed by RPE cells and MT-3 by cells of the neural retina. MT is induced in cultured human RPE cells under stress conditions such as the presence of glucocorticoids, interleukin-1/TNF alpha, oxygen and TGF beta 1. Cultured human D407 RPE cells were transfected with plasmids that allowed the expression of MT to be controlled via the tet operator protein by the level of tetracycline in the medium. These experiments showed that elevation of MT levels by transfection of RPE cells protects them against toxic levels of cadmium, heme- and iron-induced oxidation and UV light-induced apoptosis.     

Melatonin protects human retinal pigment epithelial (RPE) cells against oxidative stress

Oxidative stress is involved in the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). Administration of conventional antioxidants has been shown to slow the progression of AMD and vision loss. Melatonin, an endogenous neurohormone produced by the pineal gland and retina, has been reported to be a potent antioxidant and free radical scavenger. In this study we tested whether melatonin can protect retinal pigment epithelial (RPE) cells against hydrogen peroxide (H(2)O(2))-induced cell death. Since mitochondrial DNA (mtDNA) is preferentially susceptible to oxidative damage, we tested whether melatonin can reduce H(2)O(2)-induced mtDNA lesions. A human RPE cell line (ARPE-19) was cultured and exposed to H(2)O(2) (100 and 200 microm) for 1 hr to induce cell death. Prior to H(2)O(2) treatment, cells were treated with various concentrations (0.1-200 microm) of melatonin for 2, 24 or 72 hr. Control cells received either melatonin or ethanol alone. Cell viability, as determined by MTT assay, showed no significant (P>0.05) protection against H(2)O(2) toxicity in cells receiving 2- and 24-hr pretreatment of melatonin at either concentration. However, when melatonin was administered diurnally for 3 consecutive days, this prolonged treatment markedly reduced H(2)O(2)-induced cell death (P>0.05) MtDNA damage, as assessed with quantitative PCR, was significantly decreased (P<0.05) in RPE cells pretreated with melatonin as compared to those without melatonin treatment. These results suggest that melatonin may play a role in protecting RPE cells from oxidative stress.     

视网膜色素上皮细胞线粒体DNA的氧化损伤研究

目的研究体外氧化应激模型中视网膜色素上皮(RPE)细胞线粒体DNA(mtDNA)的损伤规律。方法以过氧化氢(H2O2)诱导建立体外RPE细胞氧化应激模型,对模型中细胞mtDNA损伤进行检测,并与细胞存活率和细胞内活性氧(ROS)浓度的变化相比较。结果mtDNA损伤程度随H2O2浓度升高和作用时间延长而增加;较之细胞存活率和ROS浓度改变更为敏感。结论在RPE细胞的氧化应激中存在mtDNA的损伤改变,它与氧化剂之间具有明显的浓度与时间的依赖性。     

内皮素对人视网膜色素上皮细胞黏附的影响

目的 探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)黏附作用的影响.方法 用RPE黏附实验和放射免疫测定法检测不同浓度ET-1对RPE黏附的影响和6-Keto-PGFal的浓度变化.结果 10-11～10-mol·L-1～ET-1对RPE细胞黏附力呈剂量依赖性增加,而RPE细胞黏附力随着ET-1浓度的进一步增加(10-9～10～mol·L-1)呈剂量依赖性下降(F=6.352,P＜0.01);黏附实验上清液中6-Keto-PGFα1含量随着ET-1浓度增加呈浓度依赖性增加(F=33.929,P＜0.01).结论 ET-1对RPE有促进黏附作用,ET-1刺激后6-Keto-PGFα1含量上升,与RPE细胞对ET-1作出的反应有关,并抑制ET-1作用.     

CERKL通过激活SIRT1/E2F1轴减轻蓝光导致的人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤

目的：探讨神经酰胺类似蛋白(CERKL)是否通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)/E2F转录因子1(E2F1)轴减轻蓝光导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤。

方法：培养人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞,蓝光照射后观察细胞形态变化,PCR与蛋白免疫印迹法测定细胞CERKL的表达情况; 分别采用siRNA-CERKL与pcDNA3.1-CERKL转染ARPE-19细胞,蓝光暴露处理后,采用MTT法测定细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡情况,分析氧化应激标志物的含量与SIRT1/E2F1轴的表达情况; 随后转染siRNA-SIRT1至ARPE-19细胞,再次测定蓝光照射下细胞氧化应激损伤状况。

结果：蓝光照射后,ARPE-19细胞逐渐收缩成圆球状,且出现空泡; 蓝光照射导致CERKL表达水平升高(P<0.05),同时观察到细胞活力降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),活性氧、丙二醛与8-羟基脱氧鸟苷含量升高(P<0.05); 沉默CERKL会加剧此现象,而上调CERKL则能缓解此变化(P<0.05); 上调CERKL同时激活了SIRT1表达,促进了E2F1的脱乙酰化(P<0.05),而沉默SIRT1能逆转上调CERKL对蓝光导致ARPE-19细胞氧化应激损伤的缓解作用(P<0.05)。

结论：CERKL通过激活SIRT1表达,促进E2F1脱乙酰化,从而减轻蓝光诱发的ARPE-19细胞氧化应激损伤。     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的:了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡情况。方法:将培养的人RPE细胞置于含10mL/LO2、50mL/LCO2和940mL/LN2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1,3,6,12,24h,利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucle-otidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平。结果:常氧状态下RPE细胞生长良好,几乎没有凋亡(TUNEL法测凋亡指数为1.2)。缺氧条件下,RPE细胞发生了不同程度的凋亡,缺氧后3h凋亡水平达峰值(凋亡指数为34.43)。结论:缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡,提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生。     

紫外线A对人视网膜色素上皮细胞渗透压小分子物质转运的影响

目的：紫外线A是否引发渗透压小分子物质向视网膜色素上皮细胞内积聚。

方法：视网膜色素上皮细胞经紫外线A照射、高渗和低渗培养后不同时间点,通过定量PCR方法测定甜菜碱/γ-氨基丁酸转运蛋白,钠依赖式肌醇转运蛋白和牛磺酸转运蛋白mRNA的表达水平,通过放射性同位素标识的渗透压小分子物质测量渗透压小分子物质在不同实验条件下的细胞内外转运过程。

结果：本研究证明视网膜色素上皮细胞表达甜菜碱/γ-氨基丁酸转运蛋白,钠依赖式肌醇转运蛋白和牛磺酸转运蛋白mRNA。高渗(400mosmol/L)相对于等渗(300mosmol/L)引发甜菜碱/γ-氨基丁酸转运蛋白、钠依赖式肌醇转运蛋白和牛磺酸转运蛋白的mRNA升高约3～5倍。高渗同时引发放射性同位素标记的渗透压小分子物质细胞内积聚。相反,低渗(200mosmol/L)引发渗透压小分子物质外流至细胞外。紫外线A照射明显引发渗透压小分子物质向细胞内摄入。与此同时,紫外线A照射还引发细胞膜相应转运蛋白的mRNA的上调。

结论：本实验表明紫外线A可以引发与高渗相类似的渗透压小分子物质的细胞内积聚效应,这种效应对保持细胞内稳态有重要作用。     

生长激素释放多肽对高糖诱导视网膜色素上皮细胞的保护作用

目的：探讨生长激素释放多肽(Ghrelin)对高糖环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化应激的影响。

方法：将体外培养的RPE细胞分为阴性对照组、高糖组、Ghrelin低浓度组、Ghrelin高浓度组。通过CCK-8法检测细胞存活率,氧敏感荧光探针H₂DCFDA染色法观察细胞氧化损伤程度,流式细胞技术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,分光光度计比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

结果：CCK-8结果显示,分别用10^-9mol/L、10^-6mol/L Ghrelin预处理后,RPE细胞存活率分别为54.79%±3.43%和79.16%±3.29%,与高糖组(41.65%±3.42%)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。H₂DCFDA荧光探针染色结果显示,Ghrelin预处理后RPE细胞内ROS生成量下降,氧化损伤细胞减少。分光光度计比色法结果显示,与高糖组相比,Ghrelin组细胞SOD活力增加,MDA含量下降。

结论：Ghrelin可以抑制高糖诱导的人RPE细胞氧化损伤,其在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中可能具有一定的细胞保护作用。     

视网膜色素上皮细胞在增生性玻璃体视网膜病变中的作用

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是在炎症和免疫功能细胞及多种活化因子对眼内细胞修复反应的调控过程中,由于过度促进细胞增殖、移行以及由细胞介导的胶原收缩而形成的。参与PVR的细胞目前已知的有5种,其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是最主要的,本文将影响RPE细胞功能的各种影响因素及PVR的治疗进展作一综述。