酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ的构建及自激活检测

目的 构建耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)R1 ppr Ⅰ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与ppr Ⅰ相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增ppr Ⅰ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了ppr Ⅰ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用.结论 成功构建了ppr Ⅰ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的 研究早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达.结果 成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD-PML-B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD-PML-C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled-coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础.     

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选北大核心CSCD

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_pprⅠ的构建及自激活检测

目的构建耐辐射球菌（Deinococcvz radiodurans）R1 pprⅠ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与pprI相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增pprⅠ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_pprⅠ转化到酵母细胞AH09中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果成功扩增了pprⅠ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用。结论成功构建了pprⅠ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

用酵母双杂交系统筛选抗人p53单链抗体

目的采用重叠PCR技术,构建小鼠抗人p53基因的全套单链抗体(sc Fv)文库,利用酵母双杂交系统筛选抗人p53sc Fv。方法构建表达p53诱饵载体p GBKT7-p53,提取P53蛋白免疫的小鼠脾脏组织总RNA,反转录PCR和重叠PCR方法构建VH-linker-VL型sc Fv基因库。将其与载体p GADT7连接,产物转化至含诱饵载体的AH109酵母菌中,于营养缺陷型平板中筛选阳性克隆。采用免疫细胞化学染色方法验证sc Fv与人P53蛋白的亲和力。结果成功构建诱饵质粒p GBKT7-p53并转入酵母AH109细胞,其在酵母细胞中无自激活能力,对宿主菌亦无毒性;成功获取VH-linker-VL型的抗体文库并构建捕获载体,利用酵母双杂交系统成功筛选到抗人P53 sc Fv片段;sc Fv1、sc Fv2和sc Fv3与人P53蛋白间均具有一定亲和力,可用以检测细胞、组织中的P53蛋白。结论利用酵母双杂交系统,获得具有良好的亲和力抗人P53 sc Fv,为筛选sc Fv提供新思路。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

人星状病毒非结构蛋白nsP1 a／1相互作用的宿主细胞靶蛋白筛选

目的：利用细菌双杂交技术筛选与人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1相互作用的蛋白。方法培养人肠道细胞HT29,提取基因组,利用细菌双杂交系统载体pUT18 C构建HT29基因组文库,同时构建诱饵载体nsP1a／1?pKT25。将文库和诱饵载体共转化进入细菌BTH101,在M63培养基上进行筛选。结果通过酶切鉴定以及测序分析,诱饵载体构建正确,并且利用细菌双杂交技术成功从HT29细胞基因组文库中筛选出能与人星状病毒非结构蛋白 nsP1a／1相互作用的蛋白。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1的诱饵载体,在HT29细胞基因组文库中筛选得到了3个与nsP1a／1相互作用的蛋白,为进一步研究人星状病毒在细胞内的增殖和防治药物的应用奠定基础。     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞...     

人肝再生增强因子cDNA的克隆及其酵母双杂交载体的构建

目的：获取人肝再生增强因子（hALR)阅读框的cDNA及构建其酵母双杂交系统的“诱饵”质粒。方法：利用RT－PCR方法，从人胎肝组织中扩增出一约380bp的DNA片段，重组入pGBKT7载体中，构建成pGBKT7-hALR，然后研究此重组质粒在酵母AH109中的表达情况并用于筛选人肝cDNA文库，结果：获得的378bp的DNA序列与文献报道的人ALR序列一致；转化的酵母细菌在选择性培养基SD／-Trp上培养65小时，长出约Φ1mm大小的白色菌落，而在SD／－Trp/-His上不生长；酵母提取液的Western blot分析，证实ALR基因在AH109以融合蛋白的形式表达，并具有免疫活性；初步得到hALR相互作用的阳性克隆。结论：pGBKT7-hALR对宿主菌AH109没有毒性作用，也没有自身激活报告基因，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定

目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体,用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列,克隆入pGBKT7?BD,将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold;用Western印迹分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中,转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B,2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B,可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。     

与人巨细胞病毒UL128两种不同结构蛋白相互作用蛋白的筛选与分析

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与两种不同转录结构的人巨细胞病毒(HCMV)UL128编码蛋白相互作用的蛋白,比较两者相互作用蛋白之间的异同点.方法 通过3'RACE和5'RACE技术扩增出两种HCMV UL128片段,其大小分别为519 bp和642 bp,并将其成功构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7中.将以上两种酵母表达载体分别转化到酵母菌AH109中,再将文库DNA转化到已含有酵母表达载体的AH109中,筛选与两种片段大小不同的UL128编码蛋白相互作用的人胎脑蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 筛出EFEMP2与UL128-519 bp编码蛋白相互作用,THY-1与UL128-642 bp编码蛋白相互作用.结论 成功构建pGBKT7 UL128-519 bp和pGBKT7 UL128-642 bp,并应用酵母双杂交系统分别筛选出EFEMP2和THY-1与UL128-519 bp和UL128-642 bp编码蛋白相互作用,在所筛选得到的相互作用蛋白之间未发现有相同的蛋白,UL128-519 bp和UL128-642 bp所编码的蛋白在HCMV感染致病过程中可能发挥不同的作用.     

BI-1作为酵母双杂交系统诱饵的载体构建

目的 用人BI-1完整编码区构建酵母双杂交系统的诱饵蛋白载体,排除自身激活作用,并证实其能否在酵母细胞中的表达,验证它能否用于酵母双杂交系统。方法 以人正常肺组织cDNA为模板,扩增BI-1完整编码区,经EcoRI、SalI双酶切后克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵蛋白载体pGBKT7-BI-1,转化酵母细胞,通过β-半乳糖苷酶活性分析验证有无自激活,Western验证其表达。结果 DNA测序显示BI-1编码区内无突变,β-半乳糖苷酶活性分析显示转入pGBKT7-BI-1和阴性对照的酵母菌落没有激活报告基因LacZ,而阳性对照菌落呈现蓝色。结论 含有BI-1完整编码区的诱饵载体不存在自身激活作用,并能在酵母细胞中表达BI-1蛋白,能够应用于酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白。     

应用酵母双杂交系统研究与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白

目的用酵母双杂交系统筛选与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白,为该7肽在体内如何发挥功能提供线索。方法构建Ang-(1-7)的真核表达载体pBD—Ang-(1—7),转化酵母菌YRG-2,进行毒性和自身非特异激活性检验。与大鼠心肌细胞文库质粒共同转化酵母细胞,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选,选择既能在3重营养缺陷培养基上生长,也能使X—gal变蓝的克隆为阳性,提取靶质粒后进行复交,将真阳性质粒测序,进行生物信息学分析。结果诱饵载体构建成功并转化酵母,对酵母无毒性,无自身激活现象。筛选出的蛋白主要参与细胞代谢和蛋白合成。结论Ang-(1-7)可能影响细胞内某些蛋白合成和细胞代谢,发挥对血管紧张素Ⅱ的结抗作用。酵母双杂交结果为Ang-(1—7)的作用途径的进一步研究提供了分子生物学线索。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

NMDA受体亚单位NR2D与MOCA相互作用的鉴定

目的:寻找N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2D的结合蛋白,为探讨NR2D在视网膜兴奋性毒性损伤中的作用提供依据。方法:构建了包含NR2D细胞内C末端的cDNA片段为诱饵质粒,应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库,并用免疫共沉淀实验进一步验证NR2D与其结合蛋白之间的相互作用,免疫荧光显微镜观察NR2D和目的蛋白在视网膜中的共表达。结果:酵母双杂交筛选到细胞黏附修饰因子(modifier of cell adhesion,MOCA)为NR2D可能的相互作用蛋白,两者在视网膜有共定位。结论:MOCA能特异结合谷氨酸受体NR2D,这为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与视网膜退行性变的机制奠定了实验基础。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

应用酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织SHIP2的相互作用蛋白

目的通过酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织标准均一化cDNA文库,寻找与含Src同源蛋白2肌醇-5-磷酸酶2(SHIP2)相互作用的蛋白。方法利用酵母双杂交系统,以SHIP2的P1(SH2+5-Ptase)和P2(PRD+SAM)段作为诱饵蛋白,筛选出人胃黏膜上皮组织均一化cDNA文库中与SHIP2相互作用的蛋白,并通过免疫共沉淀法进行验证。结果挑选出39个阳性克隆,经测序比对分析,回复性杂交,免疫共沉淀试验验证,最终确定一个与SHIP2相互作用的蛋白抗增殖蛋白1(prohibitin1/PHB)。结论酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织SHIP2的相互作用蛋白PHB。