牛磺酸对心肌成纤维细胞细胞周期的影响及其机制的研究

目的研究牛磺酸(taurine,Tau)对血管紧张素Ⅱ(an-giotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(cardiacfibroblast,CFb)增殖的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法用AngⅡ诱导新生大鼠CFb增殖,建立心肌纤维化模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖;羟脯氨酸测定检测胶原含量;流式细胞仪检测细胞周期及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p27的变化;免疫细胞化学法测定细胞周期调控蛋白D(cyclin D)及p27蛋白的含量。结果Tau(40、80、160mmol.L-1)可明显抑制AngⅡ诱导的CFb增殖与胶原合成,同AngⅡ组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01),且呈现剂量依赖性。流式细胞仪检测表明Tau在80、160mmol.L-1可促进p27的蛋白表达;细胞G0/G1期百分率随Tau浓度增加而增加,S期细胞百分率随Tau浓度增加而减少,与AngⅡ组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。免疫细胞化学染色结合图像分析系统的分析结果也表明Tau可增加p27的蛋白表达,与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论牛磺酸通过促进p27的表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期,而抑制CFb增殖和胶原含量的增加。     

牛磺酸通过抑制PKCα抗心肌成纤维细胞增殖的作用

观察牛磺酸 (taurine, Tau) 在血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ) 诱导新生大鼠心肌成纤维细胞 (cardiac fibroblast, CFb) 增殖过程中对细胞周期调控蛋白p27、Cyclin D₁及核因子-κB (NF-κB) p65的影响, 以探讨牛磺酸抑制CFb增殖的途径。胰酶消化法分离培养新生大鼠CFb, 用AngⅡ诱导促进其增殖, 采用四甲基偶氮唑盐 (MTT) 法检测细胞增殖; Western blotting法检测p-PKCα含量; 流式细胞仪检测细胞周期调控蛋白p27表达; 免疫细胞化学染色检测Cyclin D₁蛋白表达; 免疫荧光细胞化学染色法检测NF-κB p65蛋白的核表达。牛磺酸 (80和160 mmol·L⁻¹) 可明显抑制p-PKCα的蛋白表达。牛磺酸 (80 mmol·L⁻¹) 可增加p27的蛋白表达 (P < 0.05); 明显抑制NF-κB p65的核转位, 与AngⅡ模型组比较差异具有统计学意义 (P < 0.01), 而以上作用均是通过抑制PKCα在胞膜的表达而实现的, 且PKC抑制剂与Tau合用呈现协同作用。牛磺酸通过抑制p-PKCα的表达而增加p27的蛋白表达、抑制NF-κB p65的核转位, 从而抑制CFb的增殖。     

大黄素可能通过抑制Akt信号通路诱导HL-60细胞凋亡

为研究大黄素(emodin)对人髓系白血病细胞株HL-60细胞增殖、凋亡的影响及Akt信号通路在其中的作用, 应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响；细胞周期分析、线粒体细胞凋亡流式检测法分析细胞周期变化及细胞凋亡；Western blotting检测Akt信号通路蛋白表达水平的变化。结果显示，大黄素能有效抑制HL-60细胞的增殖，作用48 h的IC₅₀约为20 μmol·L^-1， 并能诱导其凋亡, 随药物作用浓度的增加， 凋亡率也逐渐上升； 大黄素作用后， HL-60细胞G_0/G1期细胞增多， 而S期及G₂期的细胞减少； Western blotting检测结果显示， 大黄素下调HL-60细胞Akt、p-Akt、IκB-α、p-IκB-α、p65、p-p65、mTOR及p-mTOR蛋白的表达。因此,大黄素能有效抑制HL-60细胞增殖，将细胞阻滞于G_0/G1期，诱导其凋亡；Akt信号通路可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖、诱导凋亡的过程。     

白芍总苷对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞的作用及机制

目的研究白芍总苷(TGP)对胶原性关节炎(CIA)大鼠滑膜细胞的作用及机制。方法采用鸡II型胶原诱导大鼠CIA模型，胶原酶和胰蛋白酶消化法分离培养大鼠滑膜细胞，透射电镜观察滑膜细胞超微结构的变化，MTT法检测滑膜细胞的增殖能力，滑膜细胞培养上清液中IL-1活性的测定采用小鼠胸腺细胞增殖法，TNFα和PGE₂含量的测定采用放射免疫测定法。结果TGP能有效改善CIA大鼠滑膜细胞超微结构的变化，抑制其过度的增殖反应和产生IL-1，TNFα和PGE₂的水平。结论TGP对CIA大鼠功能亢进的滑膜细胞具有明显的抑制作用，其作用机制可能与其抑制滑膜细胞的过度增殖和分泌能力有关。     

依那普利拉通过调控ET-1水平和NO含量抗新生鼠心室成纤维细胞增殖

目的观察血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂(angiotensinⅠconverting enzyme inhibitor,ACEI)依那普利拉(enalaprilat,Ena)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生大鼠心室成纤维细胞(cardiac fibroblast,CFb)增殖及其对内皮素-1水平和一氧化氮含量的影响,探讨Ena抑制CFb增殖的初步机制。方法以培养的新生Wistar大鼠CFb为研究对象,分为对照组、模型组、给药组3个剂量组,采用胰酶消化、差速贴壁法培养CFb,四氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖;羟脯氨酸(HYP)法测定胶原蛋白含量;流式细胞仪测定细胞周期;硝酸还原酶法和放射免疫法分别测定不同干预条件下CFb培养液中ET-1水平和NO含量。结果Ena能够明显抑制AngⅡ诱导的CFb增殖,降低HYP含量(P<0.05或P<0.01);提高细胞周期中G0/G1期百分率、降低S期百分率(P<0.05或P<0.01);降低ET-1水平、提高CFbNO含量,并呈剂量和时间依赖性(P<0.05或P<0.01)。结论Ena抗增殖的作用与改善CFbET-1水平和NO含量,即降低ET-1,升高NO含量,拮抗AngⅡ的生物效应有关。     

积雪草苷对小鼠胶原诱导性关节炎的抑制作用

研究积雪草苷(asiaticoside)对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)的作用，并初步探讨其作用机制。建立CIA模型，检测小鼠足爪炎症的肿胀度，石蜡切片HE染色对关节组织进行病理检查，MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应，Western blotting法检测关节软组织中环氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白的表达，EIA法测定关节软组织中前列腺素E₂(prostaglandin E₂，PGE₂)水平，ELISA法检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6的水平。积雪草苷(10，20及40 mg·kg^-1)灌胃给药能剂量依赖性地减轻CIA小鼠的关节炎症状，抑制CIA小鼠C II胶原诱导的淋巴细胞增殖反应，减少CIA小鼠踝关节软组织中高水平的COX-2表达及PGE₂含量，降低血清中炎症因子TNF-α和IL-6的水平；同时病理检查发现，可以改善局部关节炎症状，抑制CIA小鼠滑膜细胞增生，减轻炎性细胞浸润。结果表明，积雪草苷对CIA具有抑制作用，其机制可能与抑制淋巴细胞增殖、减少COX-2表达及促进炎症因子TNF-α、IL-6释放等有关。     

缺氧条件下白花丹醌对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡与侵袭及HIF-1α表达的影响

目的 研究白花丹醌在缺氧条件下对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、侵袭和低氧诱导因子1α(hypoxia induced factor1α，HIF-1α)及其下游基因表达的影响。方法 采用二氯化钴(CoCl₂)化学诱导法建立HepG2细胞体外缺氧模型，经不同浓度(2，4，8 μmol·L^–1)白花丹醌处理24 h后，MTT、平板克隆形成试验观察HepG2细胞增殖水平变化；使用Annexin V/PI双染流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况；使用Transwell试验观察HepG2细胞侵袭能力的变化；使用qRT-PCR检测HepG2细胞内HIF-1A mRNA转录水平变化；使用Western blotting检测细胞内HIF-1α及其下游基因c-Myc、VEGFA、MMP9和TWIST1的蛋白表达水平。结果 当CoCl₂处理浓度为150 μmol·L^–1时，HepG2细胞增殖水平未见显著变化，而HIF-1α蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，提示体外缺氧模型建立成功。与常氧对照组相比，MTT、平板克隆形成试验结果显示不同浓度白花丹醌作用HepG2细胞后，其增殖水平受到显著抑制(P<0.05或P<0.01)； Transwell试验结果显示白花丹醌可显著抑制HepG2细胞侵袭(P<0.05或P<0.01)；流式细胞术结果表明白花丹醌能显著诱导HepG2细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)；Western blotting及qRT-PCR检测结果显示，白花丹醌能显著下调HIF-1α蛋白及HIF-1A mRNA表达水平(P<0.05或P<0.01)。Western blotting检测结果显示HIF-1α及其下游基因c-Myc、VEGFA、MMP9和TWIST1的蛋白表达水平均显著下调(P<0.05或P<0.01)。结论 CoCl₂体外模拟肝癌HepG2细胞缺氧的适宜浓度为150 μmol·L^–1；在缺氧条件下，白花丹醌可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖与侵袭，同时诱导细胞凋亡，其作用机制可能与下调HIF-1α蛋白及其下游靶基因蛋白表达有关。     

依那普利拉对新生鼠心室成纤维细胞增殖的影响

目的观察血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂(angiotensinⅠ converting enzyme inhibitor,ACEI)依那普利拉(enalaprilat,Ena)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞(CFb)增殖及其对细胞周期蛋白的影响,探讨Ena抗CFb增殖的机制。方法以培养的新生Wistar大鼠乳鼠CFb为实验模型,实验分为对照组、AngⅡ组、用药3个剂量组,采用胰酶消化、差速贴壁法培养CFb,四氮唑盐(MTT)比色法检测CFb增殖;羟脯氨酸法测定胶原量;流式细胞仪、免疫细胞荧光染色法、免疫印迹法测定细胞周期和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1(cyclin dependent kinase inhib-itor,CKI)表达。结果Ena能够抑制AngⅡ诱导的CFb增殖(P<0·01,P<0·05),降低羟脯氨酸含量(P<0·01,P<0·05),提高细胞周期抑制蛋白p27kip1表达(P<0·01,P<0·05)。结论Ena能够通过提高p27kip1含量抑制AngⅡ诱导的CFb增殖。     

蒺藜皂苷对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察蒺藜皂苷(GSTT)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及相关因素的影响。方法采用培养的牛VSMC,以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为刺激因子,应用MTT法检测细胞增殖;以H₂O₂为刺激因子,应用激光扫描共聚焦显微镜检测VSMC内钙离子浓度;应用硝酸还原酶法检测培养的牛血管内皮细胞NO释放量。结果GSTT能明显抑制AngⅡ刺激的VSMC增殖,具有剂量依赖性;GSTT也能抑制H₂O₂所致的VSMC内钙离子浓度升高,使血管内皮细胞释放的NO明显增多。结论GSTT能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,此作用可能与抑制活性氧激活钙离子信号转导途径、增加血管内皮细胞NO含量等因素有关。     

黄芪抑制血管平滑肌细胞增殖及其作用机制

目的　观察黄芪(AS)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用,了解黄芪是否通过刺激VSMC产生一氧化氮(nitricoxide,NO) ,使细胞周期停滞于G₀/G₁期,从而抑制平滑肌细胞增殖。方法　[³H] 胸腺嘧啶核苷酸([³H] TdR)掺入测定VSMCDNA合成,流式细胞仪检测细胞周期情况,硝酸还原酶法测定细胞培养上清中NO水平。结果　黄芪以剂量依赖关系抑制血清诱导的VSMC[³H] 胸腺嘧啶核苷酸掺入,使G₀/G₁期细胞比例明显增多,S期细胞比例显著减少,黄芪刺激VSMC后,细胞培养上清中NO水平呈剂量依赖上升。结论　黄芪能抑制VSMC增殖,使细胞周期停滞于G₀/G₁期,这一过程可能与黄芪刺激VSMC产生NO有关     

西红花酸对心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的:探讨西红花酸(crocetin)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFB)增殖和胶原合成的影响及其作用机制。方法:体外培养新生SD大鼠CFB,建立AngⅡ诱导新生大鼠CFB纤维化模型;MTT法检测CFB的增殖;羟脯氨酸测定检测CFB胶原含量;流式细胞分析仪测定细胞周期;实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、间质胶原酶(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)的基因表达;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测细胞P27^kip1(P27)蛋白的表达。结果:(1)在一定浓度范围里,crocetin能抑制AngⅡ引起的CFB增殖和胶原合成,并呈剂量依赖;(2)CFBG0/G1期百分率随crocetin浓度增加而增加,S期、G2/M期百分率和增殖指数随crocetin浓度增加而减少,与AngⅡ组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);(3)Crocetin能明显降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原、TIMP1、TGF-β1的表达,提高MMP-2的表达;(4)Crocetin能增加P27蛋白表达。结论:Crocetin通过抑制AngⅡ诱导的CFB增殖和胶原合成起到抗心肌纤维化作用,其机制可能与细胞因子分泌和对基质金属蛋白酶的调节有关。     

牛磺酸对血管紧张肽Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用

目的：研究牛磺酸对血管紧张肽Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的抑制及对转化生长因子β_1(TGF-β_1)蛋白表达的下调作用,以探讨其对抗AngⅡ诱导的心肌纤维化的作用。方法：在AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖前后加不同浓度的牛磺酸,并采用羟脯氨酸法、MTT比色法分别测定胶原量和细胞增殖情况、SDS-PAGE电泳测胶原Ⅰ/Ⅲ型比值、ELISA法测定TGF-β_1蛋白的含量。结果：(1) AngⅡ有促进心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的作用,其浓度在1×10~(-7)mmol·L~(-1)时达最大效应；(2)牛磺酸能抑制由AngⅡ诱导的Ⅰ/Ⅲ型胶原比值增高和TGF-β_1蛋白含量的增加,其中100,200 mmol·L~(-1)的牛磺酸可抑制AngⅡ诱导的细胞增殖和胶原合成。结论：牛磺酸可用于抑制由AngⅡ导致的心肌纤维化。     

Effects of isorhynchophylline on angiotensin II‐induced proliferation in rat vascular smooth muscle cells

Proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is a crucial event in cardiovascular diseases. Isorhynchophylline, an alkaloid from a traditional Chinese medicine Gambirplant, has been used to treat cardiovascular diseases. The aim of this study was to investigate the effects of isorhynchophylline on angiotensin II (Ang II)‐induced proliferation of rat VSMCs. VSMCs were isolated from rat artery and cultured for 14 days before experimentation. The effect of isorhynchophylline on Ang II‐induced proliferation was evaluated by cell number, MTT assay and flow cytometry, and nitric oxide (NO) content and activity of NO synthase (NOS) were measured. The expression of proto‐oncogene c‐fos, osteopontin (OPN) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) mRNAs was measured by real‐time RT‐PCR. VSMC cultures were verified by morphology and immunostaining with α‐smooth muscle actin. Isorhynchophylline (0.1–10.0 μM) was not toxic to VSMCs, but markedly decreased Ang II (1.0 μm )‐enhanced cell number and MTT intensity, and blocked cell transition from G₀/G₁ to S phase. Furthermore, isorhynchophylline increased the NO content and NOS activity, and suppressed Ang II‐induced over‐expression of c‐fos, OPN and PCNA. Thus, isorhynchophylline was effective against Ang‐II induced cell proliferation, an effect that appears to be due, at least in part, to increased NO production, regulation of the cell cycle, and depressed expression of c‐fos, OPN and PCNA related to VMSC proliferation.     

D-硫酸多糖抗血管平滑肌细胞增殖作用及其机制

目的：探讨硫酸多糖（DPS）抗增殖作用及其机制,方法;用MTT法评价DPS抗大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖作用,用流式细胞仪观察DPS对VSMC胞浆内游离Ca^2 的含量、细胞周期和蛋白质含量的影响。结果：DPS在0.001-100mg/L浓度下,对AngⅡ诱导的VSMC增殖均有明显抑制作用,最佳抑制浓度为1mg/L,流式细胞术分析结果表明,DPS在抗增殖的浓度（1mg/L）下能抑制VSMC从G0/G1到S期的转换,阻止VSMC进入G2/M期;减少VSMC蛋白质的合成、DPS能明显抑制胞浆内游离Ca^2 浓度的升高,此作用可被一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）所阻断,提示一氧化氮可能介导了DPS降低胞浆内游离Ca^2 浓度的作用。结论：硫酸多糖DPS可拮抗AngⅡ诱导的VSMC增殖,其作用机理可能与降低胸浆内游离Ca^2 浓度,抑制VSMC的DNA及蛋白质合成有关。     

丝裂素活化蛋白激酶反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌？…

AIM: To investigate the inhibitory effect of down-regulating mitogen activated protein kinase (MAPK) on c-myc gene expression and further on cardiac fibroblast proliferation. METHODS: Cultured neonatal rat cardiac fibroblasts was pretreated with a phosphorothioate-protected 17-mer antisense MAPK oligodeoxynucleotide (ODN) directed against the initiation of translation sites of the p42 and p44 MAPK isoforms by liposomal transfection. A 17-mer sense and mismatch sequence MAPK ODN were used as controls. After liposomal transfecting, cells were exposed to angiotensin II (Ang II) 10 nmol.L-1 for 5 min and then harvested in lysis buffer. MAPK activity was measured by Western blot and P-81 phosphocellulose filter paper method by using [gamma-32P]ATP and myelin basic protein as substrates. c-myc mRNA expression stimulated by Ang II for 30 min was measured by Northern blot. DNA synthesis and collagen protein synthesis induced by Ang II for 24 h were measured by [3H]thymidine incorporation and [3H]Proline incorporation, respectively. RESULTS: Antisense ODN 0.2 mumol.L-1 reduced Ang II-induced MAPK activities by 72%, MAPK protein expression by 80%, and suppressed c-myc mRNA expression by 97%, respectively. [3H]thymidine incorporation and [3H]proline incorporation in Ang II-induced cardiac fibroblast were inhibited by 59% and 58%, respectively. CONCLUSION: A 17-mer MAPK antisense oligonucleotide directed againsts the initiation of translation sites of MAPK could specifically inhibit Ang II-stimulated cultured neonatal rat cardiac fibroblast proliferation through down-regulating MAPK activity and further depleting c-myc mRNA expression.     

双苯氟嗪对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制研究

目的研究双苯氟嗪(d ipfluzine,D ip)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(card iac fibrob lasts,CFB)增殖和胶原合成的影响,并探讨其抑制心肌纤维化的机制。方法用消化法培养新生SD大鼠CFB,建立AngⅡ诱导新生大鼠CFB纤维化模型。采用MTT法检测D ip对CFB增殖的影响;羟脯氨酸测定检测CFB胶原含量;流式细胞分析仪技术检测细胞周期及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达;RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和转化生长因子β1(TGF-β1)的基因表达;免疫组织化学染色方法,观察心肌成纤维细胞经典型蛋白激酶Cα亚型(cPKCα)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1)蛋白的表达。结果①在一定浓度范围内,D ip能明显抑制AngⅡ诱导CFB的增殖和胶原合成(P<0.05或P<0.01)。②CFB细胞G0/G1期百分率随D ip浓度增加而增加,S期、G2/M期百分率和增殖指数随D ip浓度增加而减少,与AngⅡ组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。③D ip能降低PCNA蛋白表达,与AngⅡ组相比差异有显著性(P<0.01)。④D ip能够明显降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原和TGF-β1mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。⑤免疫组化结果显示D ip(10、100μmol.L-1)组ERK1和cPKCα阳性表达低于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01)。结论D ip通过抑制AngⅡ诱导的CFB增殖和胶原的增加而起到了抗心肌纤维化的作用,其抗纤维化作用与其降低TGF-β1基因表达以及抑制cPKCα、ERK1通路有关。