熊射出精子体外获能的研究

本文报道了用咖啡因和Ionophore A23187(Ⅰ-A)诱导熊射出精子体外获能的研究。用去透明带仓鼠卵穿透试验评价获能效果,用台盼兰—姬姆萨(TG)染色检测精子的死活及顶体形态。结果发现,咖啡因与Ⅰ-A能诱导熊精子体外获能,经获能处理的精子能穿入卵内,穿透率达70％以上,并能形成发育良好的雄原核。咖啡因与Ⅰ-A能在体外诱导熊精子的顶体反应,相关分析表明,有顶体反应活精子百分率与穿透率呈强正相关(r=0.94,n=6,P<0.01)。TG染色是检测精子顶体反应的有效手段,并能预测获能处理后精子的受精能力。     

卵母细胞体外成熟体外受精生产犊牛

建立的牛体外受精（ＩＶＦ）程序包括屠宰厂采集卵巢、卵母细胞外培养成熟（ＩＶＭ０、精子体外获能受精和受精卵体外发育成胚泡。将卵巢置于２３℃－３８℃的生理盐水中运输，能使大量的卵母细胞在体外成熟和体外受精后发育成胚泡。卵泡切开后，用一匙子将其内容物刮出以采集多个卵母细胞，而不用１８号针头抽取，这样每对卵可采集卵母细胞１３．４个，用针头抽取每对卵巢仅能采集７．２个。体外成熟和体外受精后，卵裂能力取决于卵     

发情牛血清和绵羊卵泡液对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

本试验研究了绵羊卵泡卵母细胞在体外成熟时,以M-199为基础液,加入FBS,OCS,以及不同直径(小于8mm或大于10mm)卵泡的卵泡液对体外成熟率和体外受精率的影响。在添加同等浓度促性腺激素(FSH,0.4μg/ml;LH,2iu/ml)时,添加5%FBS或5%OCS的成熟率分别为10.00%和69.30%(P<0.05);体外受精分裂率分别为0和60.84%(P<0.05)。在添加以上浓度促性腺激素和5%OCS的基础上添加3%大卵泡液或小卵泡液时,卵母细胞成熟率分别为53.10%和78.20%(P<0.05);体外受精分裂率分别为50.00%和71.67%(P<0.05)。结果表明,发情牛血清配合大卵泡液可以充分满足绵羊卵母细胞体外成熟的需要。     

黄牛体外受精的研究

本实验主要探讨黄牛卵母细胞体外成熟、受精及其受精后胚胎的体外培养。结果表明,卵母细胞在体外培养22小时后:80％以上的卵母细胞发育至中期Ⅱ(MⅡ)阶段。当培养液中添加促卵泡素(FSH,10国际单位/毫升)和雌二醇(E_2 1微克/毫升)时,其培养成熟的卵母细胞不仅受精率提高(83%),而且受精后卵裂率显著提高(67％,P<0.01)。 输卵管细胞单层和细胞上清液不仅能有效地克服牛胚胎的8-细胞阻断,而且对胚胎的发育具有显著的促进作用,二者在培养效果上差异不显著。2—8-细胞阶段胚胎,在输卵管细胞单层、输卵管细胞上清液和对照组(TCM199+10%小牛血清)中培养5天后,分别有77％、74％和27％的早期胚胎发育到桑椹或囊胚。     

人绒毛膜促性腺激素注射后取卵时间对卵子及胚胎质量的影响

目的探讨人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后不同取卵时间对辅助生殖技术(ART)周期中卵子及胚胎质量的影响。方法回顾性分析2012年8月—2013年6月在我院行体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植术(IVF/ICSI-ET)长长方案治疗的1 500个取卵周期。按注射hCG后取卵时间的不同,分为A组(注射hCG后35.0~35.5 h),B组(注射hCG后35.6~36.0 h)和C组(注射hCG后36.1~36.5 h),比较三组的基本情况、促排卵情况、获卵率、成熟卵率、受精率、卵裂率及优质胚胎率。结果女方年龄、体质量指数、不孕年限、基础激素水平等一般情况比较三组间无统计学差异(P>0.05),促性腺激素(Gn)的使用、hCG日激素水平及hCG日内膜厚度等促排卵情况比较三组间也无统计学差异(P>0.05),三组的获卵率(80.3%、80.4%、81.4%)、2PN胚胎卵裂率(98.3%、98.2%、98.5%)、优质胚胎率(72.2%、72.4%、70.9%)比较差异均无统计学意义(P>0.05)。成熟卵率和正常受精率分别为85.1%、87.4%、87.7%和75.8%、77.3%、80.8%,三组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 35.0~36.5 h的时间范围内,延迟注射hCG后取卵的时间能够改善卵子成熟率及正常受精率,但对获卵率、卵裂率、优质胚胎率没有影响。     

不同培养体系对猪卵母细胞体外发育潜力的影响

目的:研究猪卵母细胞体外成熟的最佳条件,为用体细胞核移植的方法生产转基因克隆猪提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。方法:采用猪卵母细胞体外成熟技术,研究了不同激素组合、猪卵泡液、半胱氨酸和颗粒细胞对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。结果与结论:以15U/mlPMSG 20U/mlhCG成熟率最高,为(70.0±3.30)%,显著高于15U/mlFSH 30U/mlLH、10U/mlPMSG 10U/mlhCG〔成熟率分别为(45.6±5.10)%,(60.0±3.30)%〕,添加激素能促进卵母细胞的分裂,添加15%的猪卵泡液成熟率最高,为(86.7±3.35)%,显著高于5%,10%和20%组〔成熟率分别为(73.3±3.35)%,(71.2±5.08)%和(70.0±6.70)%〕,添加猪卵泡液促进了激活卵母细胞的分裂,在培养基中添加半胱氨酸和颗粒细胞,实验组和对照组成熟率差异不显著(P>0.05),但孤雌激活后卵裂率显著提高(P<0.05)。     

牛卵母细胞体外成熟培养时间对体外受精及早期胚胎体外发育的影响

本文报道了牛卵母细胞经不同时间体外成熟培养对其后体外受精及早期胚胎体外发育能力的影响。 实验用的母牛卵巢从附近的屠宰场收集。卵母细胞采用穿刺抽取法采集。将外观形态正常的卵母细胞随机分成6组,在含10％发情牛血清的TCM-199培养液中分别经12(G1)、16(G2)、20(G3)、24(G4、对照组)、28(G5)和32小时(G6)的体外成熟培养(IVM)后进行体外受精(IVF),早期胚胎(2-8细胞阶段)在采用卵泡颗粒细胞作为支持细胞的单层上皮细胞液滴中进行 复合培养至囊胚及孵化囊胚阶段。结果表明,经过12—32小时IVM的牛卵母细胞,在IVF后48小时检查,卵裂率均可达到81％以上(80.9％—91.9％);但IVM时间短至12小时(G1)及超过24小时(G5、G6)的卵裂率(分别为80.9％,83.5%和83.4％)显著地低于24小时的对照组(G4,91.9%,P>0.05)。     

牛卵泡对卵母细胞的体外成熟及体外受精的影响

利用屠宰母牛卵巢，对来自不同大小和不同状态卵泡的卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）进行了系列研究。结果表明，当卵泡直径小于２ｍｍ时，卵母细胞的成熟率、卵裂率、囊胚率显著低于直径为２～５ｍｍ组和直径大于６ｍｍ组（６６．７％比８５．７％和８４．２％；６２．４％比８２．７％和７９．２％；１５．１％比２８．０％和２５．０％ Ｐ〈０．０５）。来自腔前卵泡的卵母细胞也可以成熟、受精、卵裂，甚至发     

对绵羊体外受精精子的处理方法

Cheng(1985)报道,将绵羊精子在20℃室温下保存4小时,冲洗后在高pH(7.8)的修正199绵羊血清(199-SS)中悬浮,由此获得的体外成熟卵受精率可达80％。但是,这一结果的产生是由于对精子的处理,还是因为所用公羊的精液,或其他原因,还不清楚。至于Cheng(1985)提出的精子处理方法,冲洗后的培养温度(39℃或20℃)也不清楚,还有培养时间为什么定为40分钟?这是否是影响体外受精的关键因素?为此我们进行了本项试验,目的是确定绵羊体外受精时对精子处理的温度和时间。     

山羊卵巢卵母细胞的体外受精

本试验选用10mMHepes缓冲的①TCM199+FCS(10％)+hCG(20微克/毫升);②TCM199+FCS+hCG+E_2 (1微克/毫升)和③Ham′sF_(12)+FCS+hCG+E_2三种培养基,研究了山羊卵巢卵母细胞的体外成熟和体外受精。252枚卵丘细胞层完整而致密的卵母细胞培养24—26小时,其成熟率分别为55.6％(25/45)、79.4％(104/131)和76.3％(58/76)。结果表明,TCM199和Ham′sF_(12)都是山羊卵母细胞体外成熟的合适培养基;雌激素的存在可显著地提高其成熟率;24小时的成熟培养可使山羊卵母细胞的核成熟。用17枚经①和②体外成熟的卵母细胞进行体外受精,受精率为70.6%(12/17)。将12枚受精卵(pbⅡ阶段)移植给5只受体山羊,2只妊娠,妊娠率达到40％(2/5)。其中一只妊娠受体于移植后52天因意外事故死亡,取得一只发育正常 的雄性胎羔,胎长8.5厘米。另一受体已妊娠4个月,预产期为1992年4月7日,属世界首例。     

牛核供体胚龄对核移植卵体外发育率的影响

本研究主要检测核共体胚龄对牛核移植卵体外发育率的影响，用体外受精后培养３．５－６．５日的胚胎卵裂球或培养７．５日的囊胚内细胞（ＩＣＭ）细胞与去核，并经电激活处理成熟的卵母细胞进行融合，融合卵与卵丘细胞体外共培养１０日，来自３．５－６．５日龄胚胎的卵裂球与去核卵母细胞的融合率（７８％－８８％）以及核移植卵发育至囊胚胎的体外发育率（６％－１０％）不受核供体胚龄的影响，然而，内细胞群细胞的融合率明显降低     

绵羊体外受精试验

本试验用两种来源的卵母细胞,以钙离子载体诱导绵羊鲜精获能,进行体外受精。从屠宰绵羊卵巢上吸取的卵母细胞其受精卵发育率为30.6％,排出的卵子受精卵发育率为38.1％。当排卵至冲卵时间延长时,受精卵发育率降低(46.2％→28％)。降83枚232细胞受精卵移植给30只受体,2个情期未返情的羊6只,其中1只移植后58天因脑包虫死亡,腹内有1只公羔。     

马的冷冻精液

不同公马精液的耐冻性是有差异的,必须将品质良好的精液用于冷冻。每匹马输精1—2次,产驹率42—50％。 先将采得的鲜精过滤除去胶质部分,测定密度后进行稀释,稀释液有两种。 稀释液Ⅰ 葡萄糖60克,乙二胺四乙酸钠370毫克,碳酸氢钠120毫克,二水柠檬酸钠375毫克和双蒸水100毫升。然后加青霉素5万国际单位和链霉素50毫克。水浴加热到95℃,持续15分钟。     

海南黑山羊幼畜诱导卵泡发育与体外胚胎移植的应用研究

本研究旨在提高海南黑山羊幼畜诱导卵泡超数发育与体外胚胎移植扩繁后代的应用效率。比较了供体羔羊激素处理方案、羔羊卵母细胞体外成熟体系,并通过幼畜体外胚胎移植扩繁。结果发现,采用间隔12 h对供体羔羊连续6次等剂量肌肉注射FSH,在最后一次注射FSH的同时给予250 IU PMSG,获得的卵泡数、卵母细胞数以及体外受精后胚胎卵裂率均显著高于其他实验组。比较羔羊卵母细胞体外成熟体系发现,200 nM C型利钠肽预孵育4 h然后体外成熟26 h的羔羊卵母细胞,体外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成显著优于常规成熟组和其他实验组。此外,通过幼畜体外胚胎移植获得了35只健康后代,平均产羔率达42.9%。综上,本研究对于开展JIVET技术体系在黑山羊种群扩繁的应用具有重要的意义。     

公羊精子对完整牛卵的体外穿透

科学家作了许多努力以弄清存在于绵羊和山羊间的受精屏障。实验表明,在自然状态下绵羊精子就能使山羊卵子受精,而绵羊用山羊精液授精后的受精率极低。McGovern(1973)研究表明,绵羊卵子并不具有阻 止山羊精子穿入的内部屏障,低受精率是由于绵羊输卵管中存在影响山羊精子运输、存活和获能的因子。所有试验都是在自然状态下进行的,即雌性动物通过子宫内或输卵管途径用异种精子授精。本试验将采用完全不同的方法,绵羊和牛的卵母细胞在体外培养 成熟并在体外受精。     

牛体外受精卵核移植技术的研究

将采自屠宰场的牛卵巢中的卵母细胞以TCM-199+10％FCS培养成熟,用0.1％的透明质酸酶将卵丘细胞除去,以10微克/毫升的细胞松弛素B处理胚胎后,用固定在显微操作器上的微吸管将卵母细胞透明带内第一极体下面的细胞质吸去一部分,然后将取自体外受精后发育至8细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙之中,将移入卵核的卵母细胞置于融合液中并施以110V,40微秒的脉冲刺激后,将胚胎移入TCM-199+5％OCS的培养液中培养,以观察胚胎的融合率及发育率。结果表明,核移植胚的融合率为71.1%(27/38),发育为2-8细胞期的胚胎占培养的核移植胚胎总数的42.3％(11/26),其中有1枚胚胎发育至桑椹胚阶段。     

异种卵泡液对牛卵母细胞体外成熟率的影响

本研究探讨了异种卵泡液对牛卵母细胞体外成熟率的影响。结果表明,在培养基中添加适当浓度的山羊、绵羊、骆驼卵泡液代替血清,牛卵母细胞的成熟率(67．9％、68．5％、65．3％)与血清对照组(72．0％)无显著差异(P＞0．05);在添加山羊、绵羊、骆驼卵泡液的基础上补充激素,卵母细胞的成熟率(70．8％、72．9％、69．7％)也未见明显提高(P＞0．05)。     

高压氧对精索静脉曲张家兔附睾组织学影响的实验研究

目的研究高压氧(HBO)对精索静脉曲张(VC)家兔附睾组织学的影响,探讨精索静脉曲张导致男性不育的发病机制。方法采用HBO干预精索静脉曲张家兔模型,对睾丸、附睾的重量,附睾不同节段精子活力,附睾的组织形态以及精液参数进行研究。结果与未行HBO干预的VC模型比较,HBO 干预后的VC模型精液质量明显改善,睾丸、附睾重量明显增加(P值均<0．01),左侧附睾尾部Ⅱ级以上精子明显增加(Ⅱ级57．43％±6．48％,Ⅲ级2．91％±1．51％)(P<0．01,<0．05)。附睾上皮结构改善,腔内精子密度增加。结论 VC可导致附睾病理损害、精子成熟和获能障碍。慢性缺血、缺氧及其微循环障碍是导致附睾病理损害、精子成熟和获能障碍的主要机制。HBO可有效抑制VC致附睾的病理损害进程。     

血清与卵泡液中血管内皮生长因子在控制性超排卵周期中的变化

目的 本研究通过观察控制性超排卵患者的血清及卵泡液中血管内皮生长因子的变化,探讨血管内皮生长因子与卵泡发育的关系。方法 50个行体外受精-胚胎移植治疗周期的患者为研究对象。分别于月经周期第2天、取卵日抽取静脉血20例,收集取卵日卵泡直径≥18mm或≤16mm卵泡的卵泡液各25例,用酶联免疫吸附试验方法测定VEGF的浓度。结果 取卵日血清VEGF水平(116.9±17.1)mg/L较月经第2天的(92.0±17.2)ng/L明显增高(P<0.001);取卵日卵泡直径≥18mm卵泡液中VEGF水平(1630.6±144.8)ug/L较卵泡直径≤16mm(1475.9±155.5)ng/L高(P<0.05);20例取卵日卵泡液水平(1492.8±184.9)ng/L显著高于同期血清的(116.9±17.1)ng/L(P<0.001)。结论 控制性超排卵周期中血清及卵泡液中VEGF水平均升高,可能参与卵泡发育、卵母细胞成熟。     

一氧化氮对人精子获能及顶体反应的影响

目的：探讨一氧化氮(nitric oxide，NO)对人精子获能及顶体反应(acrosome reaction，AR)的影响。方法：在48例健康生育男性的精子悬液中加入不同浓度的NO供体硝普钠(SNP)，于37℃孵育1h获能，用孕酮诱导AR15、30、45、60min，采用磷酸苯二钠法分别检测精子获能前后及AR各时间点的精子悬液上清中酸性磷酸酶(ACP)，同时用CASA分析精子运动参数，观察NO对精子获能及AR的作用。结果：NO浓度在50～100nmol／L时精子悬液中ACP活性增高，精子运动参数明显增强、150～200nmol／L时ACP活性及精子运动参数变化不大、2．50～300nmol／L时精子悬液中ACP活性和精子运动参数明显降低。结论：NO对精子获能和AR具有双重性，在低浓度下有促进精子获能、AR和精子运动参数增强，而在高浓度下有抑制作用，这对精子受精能力的研究有一定的价值。精子ACP检测对精子群体获能和AR状态的评价是种较为客观可靠的方法。