庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达

目的　获取具备免疫反应原性的庚型肝炎病毒ＮＳ３ 抗原。方法　从重组质粒Ｉｗｑ２利用ＰＣＲ 反应扩增出ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段,克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸ ＨＴａ 后进行核苷酸序列测定,待鉴定正确后经ＩＰＴＧ 诱导重组工程菌,用ＳＤＳＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 对重组蛋白进行鉴定。结果　酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明成功地构建了重组工程菌ｐＨＴＮＳ３／ ＤＨ５α且克隆的基因片段为ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析诱导表达产物发现在相对分子质量约４３ ８１０处有一条明显的蛋白表达带,占菌体总量的１７ ．７ ％ 。用ＮｉＮＴＡ 亲和层析柱快捷地获得了纯化的重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定发现重组蛋白可与ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＲＮＡ 阳性病人血清发生抗原抗体反应。结论　获得了具备免疫反应原性的ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 抗原,该重组蛋白可用于ＧＢＶＣ／ＨＧＶ 感染的检测。     

庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的 …

目的 在大肠杆蓖中表达ＨＧＶ ＮＳ５抗原,以建立ＨＧＶ抗体血清学检测方法。方法 利用扫转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法从人血浆中分离庚型肝炎病毒ＮＳ５部分基因,克隆到ｐＲＳＥＴ Ａ载体,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明克隆序列正确。以ｐＰＲＯＥＸ－１为表达载体,转化ＤＫ５α,诱导表达后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量（Ｍ     

中国庚型肝炎病毒河南株非结构基因（NS）3区cDNA的克隆 …

目的 为了研究中国庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ３）区基因结构特征。方法 利用逆转录－半巢式－聚合酶链反应从河南１份ＨＧＶ ＲＮＡ阳性血清获得覆盖ＨＢＶ ＮＳ３全长ｃＤＮＡ的４个片段，并克隆到ｐｃＤＮＡⅡ载体中，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列。结果 发现克隆到的包括ＨＢＶ ＮＳ３区在内的ｃＤＮＡ序列和度为２１３７个核苷酸，编码７１１个氨基酸。与国内外已测定的５株全序列的相     

中国株HGV NS3 区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的研究ＨＧＶＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法将中国株ＨＧＶＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴＢ和ｐＲＳＥＴＣ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ、Ｐ３和Ｐ４的分子量分别为４２０００,３００００和２４０００,在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ反应中均可被ＨＧＶ阳性血清识别,其中ＨＧＶＮＳ３区Ｎ端的基因产物抗原性较强。结论中国株ＨＧＶＮＳ３区的Ｎ端存在优势的抗原决定簇,其基因产物有较好的抗原性。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重组质粒的构建及序列分析

目的：构建ＨＳＶ１ 型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐ ＵＣ１８／ ＴＫ 重组质粒ＤＮＡ 为模板,用ＰＣＲ 方法扩增ＴＫ５′端５０３ｂｐ 基因片段,并将扩增的片段克隆入载体ｐ ＵＣ１８ 中（ｐ ＵＣ１８／ＴＫ１） ;用Ｐｓｔ Ｉ 和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ｐＵＣ１８／ ＴＫ, 获得ＴＫ３′端３８３ｂｐ 片段, 将此酶切片段克隆入ｐＵＣ１８／ ＴＫ１ 中, 并进行测序。结果： 构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ ＴＫ－ 。经酶切鉴定获得１ 条约９００ ｂｐ 的基因片段; 序列测定证实, ＨＳＶ１１７ｓｙｎ ＋ ＴＫ 基因缺失了第４９３ ～７４４ 位２５１ 对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的ＨＳＶ１／ＴＫ－ 基因重组质粒,为研制其突变株奠定了基础。     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更 …

目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原ＣＡ－Ｈｂ３筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆ＥＬ５Ｄ、ＥＬ６Ｄ和Ｃａｌ２,测定３个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为２２０、５００、５００ｂｐ。测序结果表明,ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２属ＶＨ５－Ｄ－ＪＨ４,仅为ＶＨ结构亚单位,而ＥＬ５Ｄ属Ｖｋ的Ｊｋ１,     

中国株HGV NS3区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的 研究ＨＧＶ ＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株ＨＧＶ ＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴ Ｂ和ｐＲＳＥＴ Ｃ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ,Ｐ３和Ｐ４的分子     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

中国人β神经生长因子基因的分子克隆、序列分析及其在哺乳动物细胞中的分泌表达

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出短体前β神经生长因子（ｐｒｅ－ｐｒｏ－β－ＮＧＦ）编码基因。将所得基因片段重组于Ｍ１３噬菌体载体，筛选得到含中国人ｐｒｅｐｒｏ－β－ＮＧＦ基因的克隆。采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体ｐＥＶ１，经转染哺乳动物细胞ＢＨＫ后，在培养上清中检测到了成熟型β－ＮＧＦ。     

抗—HEV单克隆抗体B4C重链可变区基因的克隆及初步表达

抗－ＨＥＶ８７Ａ株单克隆抗体（ｍＡｂ）Ｂ４Ｃ的经体外研究鉴定，证实对我国暴发和散发性ＨＥＶ毒株有很高的特异性。为从分子水平上了解ｍＡｂＢ４Ｃ，我们利用基因工程技术，从杂交瘤细胞系中克隆出了重链可变区基因，并对其全部核苷酸序列进行了分析，可能属于小鼠免疫球蛋白重链Ｉ亚组，将ＶｎｃＤＮＡ克隆到高效表达载体ｐＱＥ－３１中，经ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见１条Ｍｒ的１６０００左右的表达带，表达产     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

中国人β神经生长因子基因的分子克隆,序列分析及其在哺乳…

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出短体前β神经生长因子编码基因。将所得基因片段重组于Ｍ１３噬菌体载体，筛选得到含中国人ｐｒｅｐｒｏ－β－ＮＧＦ基因的克隆。采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体ｐＥＶ１，经转染哺乳动物细胞ＢＨＫ后，在培养上清中检测到了成熟型β－ＮＧＦ。     

中国人庚型肝炎病毒E1区5＇端基因相关多肽的抗原性初步研究

用逆转录－ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从１例中国庚型肝炎（ＨＧＶ）患者血清中扩增出含Ｅ１前区部分基因及Ｅ１区５＇端共３０９ｈｐ基因片段。对其中包括Ｅ１区９６ｂｐ在内的１２０ｂｐ核苷酸进行了序列分析，发现此区段基因与录入号为Ｕ４４４０２Ｇｅｎｅｂａｎｋ报道的美国发现的ＨＧＶ相关序列具有９３％的同源性，氨基酸的同源性为９８％。Ｇｏｌｄｋｅｙ蛋白质分析程序显示，此区段的Ｅ１区可能存在抗原位点。化学合成可能为抗原位点长约２９个氨基酸的多肽Ｅ１Ｐ１。利用Ｅ１Ｐ１及ＮＳ３区内短肽ＮＳ３Ｐ１包被的ＥＬＩＳＡ方法检测了１２名非甲－戊肝炎患者血清。Ｅ１Ｐ１检出的２份血清（２／１２）中有抗－Ｅ１Ｐ１ＩｇＧ的存在。ＮＳ３Ｐ１捡出的３份血清（３／１２）中有抗－ＮＳ３Ｐ１ＩｇＧ的存在，其中包括Ｅ１Ｐ１检出的两份阳性血清。本结果说明在ＨＧＶＥ１区内至少有一个抗原位点存在。     

肝病患者中庚型肝炎病毒感染的检测

目的探讨临床肝病病人中庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）感染情况及临床特点。方法应用庚型肝炎病毒基因组５’ＵＴＲ两对寡核苷酸作为引物，建立逆转录套式聚合酶链反应，检测１６９例不同肝病患者血清标本中ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ，并对其中１例ＰＣＲ扩增产物进行克隆及测序。结果１６９例各型肝病病人ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ总的检出率为９５％（１６／１６９）。在２９例有手术输血史患者中，３１０％（９／２９）ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ呈阳性，明显高于无手术输血史组（５％，Ｐ＜００１）。序列分析显示１株庚肝病毒５’ＵＴＲ部分基因片段与已知庚肝病毒株核苷酸同源性在８９１４％～９８９１％之间。结论ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染普遍存在于临床肝病患者中，病人感染ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的临床表现未发现有特殊性，ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ可能不是非甲～戊型肝炎的主要致病因子。     

五种丙型肝炎病毒(HCV)基因重组抗原斑点酶免疫反应检测血清抗-HCV

五种丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因重组抗原斑点酶免疫反应检测血清抗－ＨＣＶ谭德明刘双虎胡国龄刘安国刘国珍应用五种丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因重组抗原，包括ＨＣＶ核心蛋白（Ｃｏｒｅ），包膜蛋白１（Ｅ１）、包膜蛋白２（Ｅ２／ＮＳ１）、ＮＳ３和ＮＳ５抗原〔１，２...     

EB病毒BHRF1基因的克隆及其表达产物抑制细胞凋亡的研究

目的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因克隆，其表达产物抑制ＣＨＯ细胞凋亡功能的研究。方法以Ｂ９５－８细胞株ＥＢＶＤＮＡ为模板设计一对引物，采用ＰＣＲ技术扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个单酶切点ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点ＮｃｏⅠ、ＳｃｌⅠ酶切目的基因后定向连接到ｐＢＶ２２１载体上，转入宿主菌ＤＨ５α经质粒抽提，单、双酶切鉴定，从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导目的基因表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶薄层扫描分析。采用缺血清培养方法建立ＣＨＯ细胞凋亡模型。结果所得扩增产物长５９２ｂｐ与预期大小一致；筛选出的９个重组质粒克隆经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和扫描表明重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的２．５％。将含重组蛋白的菌体蛋白加入缺血清培养体系，通过与空白菌体蛋白对照表明，重组蛋白具有明显的抑制ＣＨＯ细胞凋亡的能力。结论ＢＨＲＦ１蛋白具有有效控制血清缺乏所诱导的ＣＨＯ细胞凋亡功能，这为ＢＨＲＦ１蛋白的广泛应用提供了依据。     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。