用噬菌体抗体库分离NK细胞抑制受体特异性的ScFv片段

目的探讨从噬菌体抗体库分离杀伤细胞抑制受体（ＫＩＲｓ）特异性ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）的可行性及其特征。方法所用ＫＩＲ为ＮＫＡＴ２,其可溶性形式为ＮＫＡＴ２－ＩｇＧ１。噬菌体抗体库为Ｎｉｓｓｉｍ等报道的半合成抗体库。抗体库经包被免疫管的ＮＫＡＴ２－ＩｇＧ１５次筛选后,可溶性ＳｃＦｖ由ＩＰＴＧ诱导细菌而获得,筛选效果由测定噬菌体的菌落形成单位及ＤＮＡ酶切图谱分析。ＥＬＩＳＡ、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析ＳｃＦｖ特异性及免疫学特征,并进行ＤＮＡ的序列测定。结果５次筛选后,噬菌体得到２００倍的富集,酶切图谱也显示某种构型噬菌体的富集。４０个克隆的细菌上清经测试,３７个显示与ＮＫＡＴ２有较强的反应。ＳｃＦｖ经聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示相对分子质量为３０×１０３,其ＤＮＡ序列完全相同,重链ＣＤＲ３区编码氨基酸为ＥＳＮＬＶＴＣ,重链其它部分与ＤＰ３５一致。结论研究初步结果表明,用噬菌体抗体库可以快速、简便地产生用于ＫＩＲ研究的较高特异性的试剂。     

单链抗体经流式细胞仪检测细胞表面受体

用流式细胞仪检测两个自然杀伤细胞抑制受体的单链抗体（ＮＫＡＴ２－ｓｃＦｖ；ＮＫＡＴ４－ｓｃＦｖ），识别细胞表面受体分子的能力。单链抗体是吸附固相的抗原筛选一噬菌体抗体库而获得。结果显示，含ＮＫＡＴ２－ｓｃＦｖ的细菌上清及胞质提取物均可识别到表达在细胞表面的ＮＫＡＴ２受体分子，但含ＮＫＡＴ４－ｓｃＦｖ的细菌上清及胞质提取物均未成功     

抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达

目的研究人源抗人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｇｐ１２０单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法以人工合成的ＨＩＶ－ｌｇｐ１２０Ｖ３环多肽为抗原，利用噬菌体抗体库技术，筛选含有抗－ｇｐ１２０ＳｃＦｖ基因的噬菌体，提取质粒，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，表达可溶性ＳｃＦｖ。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物分子量为２８ｋＤ左右，且具有ｃ－ｍｙｃ活性；ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，可溶性ＳｃＦｖ具有较好的抗原结合活性和较强的特异性；竞争性ＥＬＩＳＡ实验结果进一步证明表达产物的特异抗－ｇｐ１２０活性。结论该技术便捷有效，可大量获得人源抗ＨＩＶ抗体片段，为进一步研究抗ＨＩＶ抗体的生物活性和ＨＩＶ感染诊治打下基础     

乙酰胆碱受体单链噬菌体抗体的筛选与鉴定

筛选乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）单链抗体（ＳｃＦｖ），制备可溶性ＡＣｈＲＳｃＦｖ以预防、治疗和诊断重症肌无力。采用电鳐电器官的ＡＣｈＲ（ｔＡＣｈＲ）以亲和吸附法，从鼠源性噬菌体ＳｃＦｖ抗体库中筛选出ＡＣｈＲ特异性抗体。以ＥＬＩＳＡ鉴定噬菌体抗体的特异性，以免疫荧光技术鉴定噬菌体抗体对人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ的结合特异性。经４轮ＡＣｈＲ筛选后，获得了能与ＡＣｈＲ结合的噬菌体抗体，这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中的ＡＣｈＲ结合。以ｔＡＣｈＲ为抗原对噬菌体抗体库进行亲和吸附筛选，可以得到ＡＣｈＲＳｃＦｖ，并且这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ特异性结合。     

抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定

目的 应用ＫＧ１ａ细胞（髓系白血病细胞系）筛选噬菌体抗体库,获得能以一定特异性结合ＫＧ１ａ细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）,克隆重其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法 用完整的ＫＧ１ａ细胞筛选一个经ＫＧ１ａ细胞免疫小鼠脾细胞的ＳｃＦｖ噬菌体抗体库,重复筛选４轮;细胞ＥＬＩＳＡ鉴定了其中９６个克隆重与ＫＧ１ａ细胞的结合反应;从２６个ＫＧ１ａ细胞ＥＬＩＳＡ阳性克隆中挑选了３个克隆重,进一步用免疫     

KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

用噬菌体展示技术构建ＫＧｌａ免疫小鼠的脾细胞ｓｃＦｖ表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系ＫＧｌａ细胞免疫小鼠,取其脾细胞,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＶＨ和Ｖｋ基因并克隆入呼 体展示表达载体,构建ｓｃＦｖ文库,并测定文库的库容量和ＢｓｔＮ１酶切单个克隆分析文库的多样性。用ＫＧｌａ作为固相抗原,进行四轮吸附－洗脱－富集的筛选,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检验筛选后文库ｓｃＦｖ的呈示表达。结果：文库的库容为３＊１０＾６ｃｆｕ     

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的表达与纯化

对已筛选到的人源性抗ＨＢｓＡｇ特异性噬菌体抗体基因文库进行表达研究，将特异性噬粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，反复冻溶法制备可溶性Ｆａｂ片段。免疫印迹实验表明大肠杆菌质周腔内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。制备羊抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗血清，建立抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱，纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化的Ｆａｂ达免疫纯，点印迹法表达纯化后的Ｆａｂ片段具有中和ＨＢｓＡ     

出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的构建

以３种方法从出血热恢复期患者外周血淋巴细胞成功地扩增出人抗体Ｖ区３种基因片段（ＶＨ，Ｖ，Ｖλ），通过桥拼接延伸反应（ＳＯＥ），以（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３为连接子，将重、轻链Ｖ区基因连接成为ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖｉｃ和ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｖλ两种单链抗体基因。然后将ＳｃＦｖ基因与载体ｐＨＥＮ１重组，转染感染受态大肠杆菌ＴＧ１，通过辅助噬菌体Ｍ１３ＫＯ７的超感染，制备成两种“噬菌体展示人源性全套ＳｃＦｖ抗     

三种抗G—CSF单链抗体基因的表达及活性鉴定

从重组人ＧＣＳＦ免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库中, 筛选到３ 个具有ＧＣＳＦ抗原结合活性的重组噬菌体单链抗体基因。将其感染不含Ｓｕｐ Ｅ的Ｅ． ｃｏｌｉ 菌株, 获得以ＳｃＦｖＥｔａｇ 形式的目的抗体片段的可溶性表达。经ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ 检测, 表达产物具有与ＧＣＳＦ抗原结合的活性。ＮＦＳ６０ 细胞株抑制实验初步表明, 表达产物具有抑制ＧＣＳＦ的作用。     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论：在大肠杆菌中成功地表达了抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）基因的融合蛋白     

抗HIVp24单链抗体的基因构建及序列测定

应用重组噬菌体抗体系统，从经过ＨＩＶ全蛋白裂解物及ｐ２４免疫过的鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建出组合单链抗体（ＳｃＦｖ）ｃＤＮＡ文库。ｃＤＮＡ文库克隆到噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，转化大肠杆菌ＴＧ１，得到２５×１０７个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现，用ｐ２４蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行两轮亲和富集获得一株特异性好的抗ｐ２４的噬菌体单链抗体。经ＥＬＩＳＡ鉴定，该噬菌体呈ｐ２４结合ＥＬＩＳＡ阳性的滴度小于１０７ｐｆｕ／ｍｌ。并对ＳｃＦｖ进行了序列分析，对今后的应用奠定了基础。     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

重组人G—CSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库？…

利用全套噬菌体抗体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，从重组人Ｇ－ＣＳＦ免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ后，用抗体中变区ＰＣＲ混合引物进行全套抗体重，轻链可变区（ＶＨ和ＶＬ）基因的扩增，经重叠延伸反应，在体外随机装配成单链抗体（ＳｅＦｖ）将其克隆至噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中，电转化含ＳｕｐＥ的Ｅ．ｃｏｌｉ菌株，以辅助噬菌体Ｍ１３Ｋ０７超感染噬菌粒文库，构建成全套ＳｃＦｖ表面展示文     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体表面展示技术,从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白ＮＳ４Ａ的单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）及其编码基因,为抗ＨＣＶ的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表达展示技术,以重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ４Ａ为包被抗原,从噬菌单链可变区抗体库中经过３轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶ ＮＳ４Ａ人单链可变区抗体段阳性克隆     

用细胞筛选噬菌体抗体库分离自然杀伤细胞抑制受体的单链抗体

目的与方法：用Ｎｉｓｉｍ等噬菌体抗体库经细胞筛选，分离自然杀伤细胞抑制受体（ＮＫＡＴ１）的单链抗体。结果：８次筛选循环后，分离到的单链抗体不但可以特异性识别到表达在细胞表面的ＮＫＡＴ１分子，而且也能与纯化的ＮＫＡＴ１蛋白结合，这些单链抗体为３１ｋＤａ的分子。结论：用噬菌体抗体库可以简便、快速产生自然杀伤细胞抑制受体特异性的单链抗体     

HER2/neu抗体对SKBR3乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响

目的研究抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ胞外区的特异性抗体对ＳＫＢＲ３乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响。方法Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法及抗体介导的特异性细胞增殖试验；筛选乳腺癌病人抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体阳性血清ＩｇＧ的ＥＬＩＳＡ方法。结果试验发现单抗ｃ－ｎｅｕ－５对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化有明显促进作用，但对细胞增殖的影响不明显；而单抗ｃ－ｎｅｕ－２对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化及细胞增殖均有明显作用。在此基础上，收集乳腺癌病人血清１４份，分离纯化其血清ＩｇＧ，并经ＥＬＩＳＡ方法筛选出５份乳腺癌病人抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体阳性血清ＩｇＧ。细胞增殖试验发现该５份标本中有３份对ＳＫＢＲ３细胞增殖有明显抑制作用。选其中１份抑制增殖的阳性血清ＩｇＧ进一步研究其对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化的影响，结果发现该病人血清ＩｇＧ对细胞酪氨酸磷酸化也有抑制作用。结论抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ的特异性抗体可能通过抑制细胞的信号传递系统而抑制肿瘤生长。     

肿瘤碱性蛋白单克隆抗体免疫学特性的研究及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术，建立了４株抗人血清肿瘤碱性蛋白（Ｔｕｍｏｕｒｂａｓｉｃｐｒｏ－ｔｅｉｎ，ＴＢＰ）杂交瘤细胞株（１Ｃ３、４Ｆ４、５Ｆ４、３Ｇ９），并以制备的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）对其抗原决定簇及免疫学特性进行了分析。Ｉｇ亚类测定：均为ＩｇＧ２ａ，腹水效价为１×１０－６～１×１０－８。特异性测定：ＴＢＰＭｃＡｂ与ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ和Ａｌｂ无交叉反应。单抗相加试验证实：５Ｆ４、４Ｆ４和１Ｃ３为识别ＴＢＰ上同一抗原决定簇，３Ｇ９则为识别ＴＢＰ上另一抗原决定簇。分别利用单株和混合株ＭｃＡｂ标酶建立了可应用于人血清ＴＢＰ含量测定的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，并用于人血清ＴＢＰ含量测定。     

抗CEA单链抗体与人hTNF-α融合基因的构建、表达和纯化

采用基因重组技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ） 单链抗体基因（ＳｃＦｖ） 与人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦ α） 基因拼接成抗ＣＥＡＳｃＦｖ ｈＴＮＦ α（免疫毒素） 融合基因, 并克隆进大肠杆菌分泌性表达载体ｐＥＴ ２２ｂ （ ＋ ） 中, 在大肠杆菌中表达了６ ×Ｈｉｓ免疫毒素融合蛋白, 其６ ×Ｈｉｓ 位于ＳｃＦｖ 的Ｎ 端, 在胞内以可溶性存在, 其表达量占菌体总蛋白的６％ , ＳＤＳ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 显示表达产物分子量为４３ｋＤ, 与其基因编码蛋白的理论推算值相符。经Ｎｉ２＋ ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱一步纯化的６×Ｈｉｓ 免疫毒素纯度可达９０％ 以上, 得率为０－２ｍｇ／１００ｍｌ。表达产物除了具有与ＣＥＡ 结合的活性, 也具有对Ｌ９２９细胞杀伤的功能。     

将抗体库所获抗-HBs Fab转换为全长人IgG

目的 将大肠杆菌表达的抗－乙肝表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ转换为真核表达的全长人ＩｇＧ１。方法 用重叠ＰＣＲ法将人工合成的人Ｖｋ前导序列拼到抗－ＨＢｓ的ＶＨ和ＶＫ上,构建人ＩｇＧ１真核表达载体。转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结果 用轻链和重链同时表达的单一载体在ＣＨＯ细胞中获得了抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结论 通过噬菌体抗体库所获Ｆａｂ段可经拼接人     

分泌抗rHuIL—6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（Ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（Ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（Ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡ