负载热休克蛋白60的致耐受性树突状细胞疫苗对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响

目的：探讨负载热休克蛋白60（HSP60）的 致耐受性树突状细胞 （DC）接种对ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化斑块的影响。 〖HTH 〗方法:制备ApoE－/－小鼠骨髓DC，分别用HSP60或HSP60加雷帕霉素（ra p）处理获得DCHSP60和rap-DCHSP60,体外检测各组DC功能。分别用CFSE 染色 的DCHSP60和rap-DCHSP60及PBS经静脉接种高脂饲养ApoE－/－小鼠3次 ，末次接种后8周观察各组斑块面积，CD4+T细胞和DC在斑块中浸润情况及脾细胞对HSP60 的反应。结果:体外HSP60负载DC CD86表达显著高于未负载DC，而致耐 受DC CD86表达显著低于未负载DC。接种小鼠后，DCHSP60组斑块中炎性细胞浸润明显 多于PBS组，DCHSP60组斑块面积大于PBS组；而rap-DCHSP60组炎性细胞浸润明 显减少，斑块面积显著小于PBS组；HSP60刺激脾细胞后，DCHSP60组IFN-γ分泌增加,而 rap-DCHSP6组IL-10分泌增加，反应呈抗原特异性。结论:负 载HSP60的耐受性DC接种可抑制HSP60特异性免疫反应，抑制动脉粥样斑块中的炎症反应和斑 块的进展。     

过继负载HSP60的致耐受性DC对小鼠血管内皮功能的影响

目的： 探讨负载热休克蛋白60（HSP60）的致耐受性树突状细胞（DC）接种对apoE-null小鼠血管内皮功能的影响。 方法： 分离apoE-null小鼠骨髓DC，分别用HSP60和HSP60加雷帕霉素处理DC，分别获得负载HSP60 DC（DChsp）和致耐受DC（DChsp+r）。体外检测各组DC的功能。分别用DChsp、DChsp+r和盐水经静脉接种高脂饲养apoE-null小鼠，共两次；设C57BL/6小鼠为未接种正常对照。末次接种后两周检测T细胞对HSP60的反应和主动脉环的内皮依赖性舒张功能。 结果： 体外HSP60可促进DC表达CD86及刺激淋巴细胞增殖，而致耐受DC其CD86表达显著下降。接种小鼠后，DChsp促进炎性反应，加重内皮舒张功能障碍；而DChsp+r明显抑制炎性反应，增强内皮舒张功能。 结论： 热休克蛋白60致耐受性树突状细胞接种可抑制HSP60特异性免疫应答，增强血管内皮舒张功能。     

NBD多肽抑制HSP60诱导的小鼠骨髓树突状细胞激活

目的观察热休克蛋白60(HSP60)对小鼠骨髓树突状细胞(dendritic cell,DC)生物学活性的影响,并探讨核因子κB必需分子(NF-κB essential modulator,NEMO)结合的小分子多肽(NEMO binding domain,NBD)对DC活性的干预作用,为NBD多肽的临床应用提供理论依据。方法培养小鼠骨髓源性DC,分为对照组、HSP60组及NBD组,对照组在正常条件下培养,HSP60组加入终质量浓度为10μg/ml的HSP60,NBD组在加入NBD(50μmol/ml)4 h后给予10μg/ml的HSP60刺激,继续培养3 d。流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的变化,ELISA法检测各组DC分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-12(IL-12)的质量浓度,免疫细胞化学检测DC核因子-κB(NF-κB)的表达,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力。结果 HSP60可促进DC高表达CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子,促进Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ及IL-12释放、NF-κB高表达并易位于核内,并诱导T细胞增殖,NBD多肽可阻断HSP60的这些效应。结论 NBD多肽可抑制HSP60诱导的DC激活。     

热休克蛋白60对小鼠树突状细胞功能影响体外研究

目的：探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60（HSP60）体外对小鼠树突状细胞（mDC）功能影响.方法：小鼠骨髓提取DC,体外培养成熟后与两种浓度mHSP60孵育,动态观察DC突起改变;流式细胞仪检测孵育前后mDC表面标志改变;MLR测定孵育前后mDC刺激功能变化;ELISA法测定MLR上清液中细胞因子浓度.结果：孵育后,mDC突起增加明显;CD11c^＋、CD80及CD86表型显著增加;淋巴细胞刺激功能明显增强;分泌细胞因子IL-12、IFN-γ增加（P＜0.01）而IL-4增加不明显（P＞0.05）,IFN-γ/IL-4比值升高.结论：mHSP60体外可以促进mDC功能,作用呈剂量依赖性.     

热休克蛋白对树突状细胞成熟的影响研究

目的:探讨热休克蛋白(HSP)对树突状细胞(DCs)成熟的影响,同时对其形态学动态变化进行研究。方法:从肝癌组织中提取HSP(gp96 )抗原肽复合物;肝癌细胞进行热休克处理诱导其表面表达HSP,再用DiI荧光标记;将两种HSP与DCs混合培养,动态观察DCs捕获抗原和成熟过程中的形态学变化。流式细胞仪检测不同情况下热休克蛋白对DCs成熟表型的影响。结果:使用DiI标记的方法良好地显示了DCs摄取抗原的形态学变化;DCs通过直接接触、包绕、形成囊泡和伸出伪足且末端形成囊泡4种方式摄取抗原;热休克蛋白可促进DCs成熟表型的表达。结论:DiI是适合DCs形态学研究的良好的荧光标记物;DCs捕获抗原有4种不同方式;不同热休克蛋白均可促进DCs成熟,但提取的热休克蛋白作用更显著。     

HSP60通过Toll样受体对ApoE~(-/-)小鼠树突状细胞功能影响研究

目的:探讨HSP60通过Toll样受体(TLR)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导在体外对ApoE-/-小鼠树突状细胞(mDC)的功能影响。方法:将ApoE-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型后,从骨髓提取DC,体外培养成熟后分三组:HSP组、LPS组及对照组,分别与HSP60、LPS及生理盐水孵育后,应用流式细胞仪检测细胞表面TLR及CD80水平,RT-PCR检测TLR的mRNA水平,免疫印迹法检测MAPK家族中p38及ERK水平;上清液用ELISA法检测IL-6及TNF-α水平。结果:与对照组比较,HSP组中DC表达TLR及MAPK家族水平、成熟标记物CD80水平、分泌IL-6及TNF-α水平均明显升高(P0.01);但与LPS组比较则无显著差异(P0.05)。结论:HSP60通过TLR介导MAPK信号转导参与动脉粥样硬化模型mDC的活化过程。     

腺病毒介导HSP70-HBsAg嵌合基因转染树突状细胞及生物学特性分析

目的 分析携带热休克蛋白70(HSP70)和乙肝表面抗原(HBsAg)嵌合基因的腺病毒表达载体感染人外周血诱导培养树突状细胞(DC)后其生物学特性的改变.方法 从正常人外周血中分离单个核细胞,经Ad-HSP70-HBsAg感染刺激后.在含细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的培养液体中体外诱导培养DC;采用荧光倒置显微镜、RT-PCR、流式细胞仪(FACS)和混合淋巴细胞反应(MLR)试验对人外周血来源的DC进行生物学特性分析.结果 Ad-HSP70-HBsAg感染后的DC能够有效表达示踪蛋白GFP和转录基因HSP70-HBsAg,病毒感染组和对照组的DC在细胞形态、DC细胞表面分子表达和刺激同种异体的人外周血幼稚型T细胞增殖能力的方面无明显差别.结论 Ad-HSP70-HBsAg可有效转染DC,感染后的病毒对DC的生长和生物学特性无显著影响.     

热休克蛋白60口服耐受对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响

目的:探讨热休克蛋白60(HSP60)口服诱导的免疫耐受对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响.方法:8周龄ApoE-/-小鼠分别口服重组鼠HSP60 PBS溶液和单纯PBS,连续5天后高脂饲养12周.观察各组斑块面积;分析脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞百分比;脾细胞抗原特异性T细胞增殖反应,ELISA法检测上清液细胞因子浓度.结果:与对照组比较,口服HSP60组斑块面积显著减小,口服HSP60组脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞百分比显著升高(P<0.01).HSP60刺激脾细胞后,口服HSP60组T细胞增殖反应下降,上清液中TGF-β浓度显著升高,而IFN-γ显著下降.结论:口服HSP60可预防动脉粥样硬化形成;口服HSP60诱导调节性T细胞介导的抗原特异性免疫耐受可能是动脉粥样硬化的机制.     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的：探讨糖基化终产物 (AGEs）)对人单核细胞源树突状细胞（MDCs）糖基化终产物受体（RAGE） 表达的影响。 方法： 用免疫磁珠分离人外周血CD14+单核细胞，经含rhGM-CSF（100 μg/L）和rhIL-4（50 μg/L）的RPMI-1640培养，使其分化为MDCs，采用RT-PCR和Western blotting法，观察糖基化-白蛋白（AGE-BSA）对MDCs RAGE mRNA和蛋白表达的影响，同时检测培养液上清中IFN-γ和IL-12的浓度。 结果： AGE-BSA诱导DCs RAGE mRNA和蛋白的表达（P＜0.05），高于空白对照组，并且明显促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌（P＜0.05）。BSA干预组与空白对照组相比差异无显著（P＞0.05）。 结论： AGEs能够上调DCs RAGE的表达，并且促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌，这可能是糖尿病通过DCs促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一。     

小鼠肝癌微波消融对瘤内注射树突状细胞归巢的影响

目的：小鼠肝癌微波消融后检测树突状细胞归巢，探讨热消融治疗激发抗肿瘤免疫效应的可能性。 方法： 建立C57BL/6J小鼠Hepa 1-6肝癌皮下移植瘤模型，不同温度微波消融后，瘤内注射荧光标记的未成熟树突状细胞(PKH26-DC)，检测PKH26-DC归巢的数量、成熟情况及对淋巴细胞的刺激作用。 结果： (65±5)℃和(90±5)℃消融组未发现PKH26-DC归巢和CCR7表达。(50±5)℃消融组和未消融组比较，归巢DC的数量为32±8 vs 21±6，CCR7表达率为100% vs 90%，100倍视野下淋巴细胞形成免疫突触的数量为8-12簇 vs 4-6簇，每簇内淋巴细胞数目为12-25 vs 3-10。 结论： 肝癌热消融能促进树突状细胞成熟和归巢，刺激淋巴细胞免疫应答，但消融温度须适当。     

热休克蛋白47和热休克蛋白60在小鼠胚胎器官形成过程中的表达

目的：研究小鼠胚胎器官形成过程中热休克蛋白47（Hsp47）和热休克蛋白60（Hsp60）的表达情况。方法：于GD11～GD18,取得小鼠胚胎脑、眼、心、肺、胃、肝、四肢,于GD13-GD18取得肾,利用RT-PCR方法半定量检测Hsp47和Hsp60在各器官的表达丰度。结果：Hsp47在GD11～GD12和GD18的脑、GD11～GD12和GD17～GD18的眼、GD11～GD12和GD16～GD18的肺、GD11-GD18的肝脏不表达,在其余时间和其余器官均有表达;Hsp60在CD11～GD18时段胚胎的脑、眼、心、肺、胃、肝、肾（GD13～GD18）、四肢中均有表达。结论：Hsp47和Hsp60在小鼠胚胎器官形成过程中有不同的表达丰度,其表达模式也不一致;Hsp47在小鼠胚胎发育过程中可能有重要功能,Hsp60则具有广泛表达的特点。     

Levels of intra- and extracellular heat shock protein 60 in Kawasaki disease patients treated with intravenous immunoglobulin

Immune reactivity to autologous heat shock protein 60 (HSP60) has been reported to be associated with a favorable prognosis in autoimmune diseases. To provide a clue for the possible role of HSP60 in Kawasaki disease (KD), we investigated the levels of intra- and extracellular HSP60 in the course of KD. In KD patients, autologous HSP60 was abundantly expressed in CD11c(+) cells during the acute phase and subsequently decreased during the subacute phase. Most of HSP60-expressing CD11c(+) cells observed in the acute phase was composed of CD11c(low) cells instead of CD11c(high) cells, which were dominant in the subacute phase. In contrast, circulating HSP60 levels were higher in the subacute phase than those in the acute phase, reflecting higher level of HSP60 exposure to the immune system of patients during recovery. These changes in the levels of intra- and extracellular HSP60 were not observed in patients with other febrile diseases. The observed features of HSP60 expression in patients with KD are in favor of a role for autologous HSP60 as a regulator for control of inflammation, rather than a proinflammatory mediator in KD.     

Extracellular heat shock protein 60 (Hsp60) levels in children with septic shock

Objective and design: Recent data suggest that extracellular Hsp60 modulates the host innate immune response. We analyzed plasma Hsp60 levels in children admitted to a level III tertiary care PICU with septic shock. Materials and subjects: Blood samples were obtained from children meeting criteria for septic shock (n = 63), critically ill children without septic shock (n = 10), and healthy controls (n = 24). Treatment: Not applicable. Methods: Hsp60 levels were measured in the plasma using a commercially available ELISA. Differences between groups were analyzed with a Kruskal-Wallis one way ANOVA due to the non-parametric nature of the data. A p value ≤ 0.05 was considered significant. Results: Extracellular Hsp60 levels were significantly higher in children with septic shock (median, 16.7 ng/mL) compared to both critically ill children without septic shock (median, 0 ng/mL) and healthy controls (median, 0 ng/mL, p <0.001). Conclusions: Extracellular Hsp60 levels are significantly elevated in children with septic shock compared with both healthy controls and critically ill children without sepsis. Extracellular Hsp60 may play a role in the pathogenesis of sepsis in children. Received 3 July 2006; returned for revision 18 October 2006; accepted by K. Visvanathan 6 December 2006