RAD001对胃癌MKN-45细胞生长影响的实验研究

目的探讨RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响及可能作用机制。方法体外培养MKN-45细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数检测MKN-45细胞数目,流式细胞术检测细胞周期分布,Western-blot检测核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶（p70S6K）、真核起始因子4E（eIF-4E）结合蛋白1（4E-BP1）、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果RAD001作用于MKN-45细胞24 h：RAD001对MKN-45细胞的生长产生抑制作用,抑制作用具有时间依赖性;MKN-45细胞细胞周期发生改变,停滞在G0-G1期细胞比例增加;MKN-45细胞的4E-BP1、p70S6K、S6无明显变化,phosphate-p70S6K、phosphate-S6表达缺失,phosphate 4E-BP1表达下降。结论RAD001是通过抑制mTOR下游通路阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节细胞周期以发挥抑制MKN-45细胞生长的作用。     

RAD001对胃癌细胞株MKN 28、N 87生长的实验研究

目的探讨RAD001作用于胃癌细胞株MKN 28、N 87后细胞生长的影响及其作用机制。方法体外培养胃癌MKN 28、N 87细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术、Western blot电泳检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布及mTOR、p70S6K、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果细胞计数结果显示RAD001作用24?h即开始出现对细胞生长的抑制作用,作用具有时间依赖性。流式细胞术结果显示RAD001作用后两细胞株细胞周期均发生改变,停滞在G0 G1期细胞比例增加,作用亦具有时间依赖性,其中N 87相对敏感。Western blot结果显示RAD001作用24?h后两细胞株mTOR、p70S6K及 phosphate mTOR蛋白表达无改变,MKN 28 S6表达下降,phosphate p70S6K表达下调,phosphate S6表达缺失;N 87 S6无明显变化,phosphate p70S6K表达下调,phosphate S6表达明显下降。结论RAD001通过与mTOR的FRB相结合,从而抑制mTOR所调节的下游p70S6K S6蛋白通路,阻断了p70S6K及S6蛋白的磷酸化和蛋白质翻译进而调节着细胞周期以发挥抑制胃癌细胞生长的作用。     

RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的VEGF表达的影响

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）特异性抑制剂RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达的影响,以期为临床治疗肿瘤提供新的线索。方法常规培养胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP,RAD001单独或联合顺铂（DDP）干预48h后,ELISA法测定药物对细胞分泌VEGF蛋白的影响,蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学法检测药物作用后细胞中VEGF蛋白的表达情况。结果RAD001单独或联合DDP干预后,SGC7901／DDP细胞分泌的VEGF蛋白减少,呈剂量依赖性;SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的表达降低。结论RAD001可以减少胃癌SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的分泌和表达,与DDP联合用药时作用更明显。     

雷帕霉素抑制mTOR信号通路对EC9706细胞生长及凋亡的影响

目的:检测食管鳞状细胞癌组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性及雷帕霉素(rapa)对食管鳞状细胞癌细胞系EC9706细胞生长及凋亡的影响.方法:采用免疫组织化学SP法检测50例食管鳞状细胞癌组织及15例正常食管组织中mTOR蛋白的表达.分别用不同浓度(20、50和100 nmol/L)的rapa处理食管鳞状细胞癌EC9706细胞系,以未处理组作为阴性对照,采用流式细胞术测定细胞周期和凋亡率.结果:食管鳞状细胞癌组织中mTOR蛋白的阳性表达率为64.0%(32/50),高于正常组织的13.3%(2/15)(χ2=11.873,P=0.001).与对照组比较,rapa可使细胞停滞于G0/G1期(F=102.609,P=0.001),且明显促进细胞凋亡(F=916.882,P=0.001).结论:mTOR信号通路在食管鳞状细胞癌中被显著激活,rapa能抑制食管鳞状细胞癌细胞生长并诱导细胞凋亡.     

雷帕霉素抑制人结肠癌细胞体外增殖及其机制研究

目的 研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTTOR特异性抑制荆雷帕霉素(Rapamycin)对体外培养的人结肠癌Lovo细胞生长的抑制作用,并初步探讨其机制.方法 分别用0.5、1.0、2.5和5.0ug/mL雷帕霉素对Lovo细胞进行干预,采用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达.结果 雷帕霉素对Lovo细胞表现出明显的增殖抑制作用,细胞增殖活性随浓度增加、时间延长逐渐降低,呈现量-效、对-效关系.雷帕霉素呈浓度依赖性诱导细胞凋亡,并明显降低Lovo细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平.结论 雷帕霉素通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,诱导结肠癌Lovo细胞凋亡,从而抑制其增殖及生长.     

雷帕霉素增强Ishikawa细胞化疗敏感性实验研究

目的:研究雷帕霉素(RA)单独或联合阿霉素、顺铂及紫杉醇对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响,为临床应用RA治疗子宫内膜癌提供理论依据。方法:应用10μmol/L RA与各1/2的半数抑制浓度(IC50)量的阿霉素、顺铂及紫杉醇联合,细胞克隆形成法和流式法检测细胞存活率和凋亡率;RT-PCR法检测RA、阿霉素、顺铂及紫杉醇对细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达影响;Western blot法检测10μmol/L RA作用6,12,24h后细胞Bcl-2蛋白表达水平。结果:RA联合化疗可显著提高各组化疗药的作用效果,降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,与单纯化疗组相比有统计学差异(P<0.05);RA可显著降低宫颈癌细胞mTOR基因mRNA水平,抑制Bcl-2蛋白表达。结论:RA通过抑制mTOR通路,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,提高化疗药物对子宫内膜癌细胞的杀伤作用。     

雷帕霉素抑制人神经母细胞瘤细胞株生长及诱导凋亡的机制研究

目的研究雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长抑制和诱导凋亡作用,以及对靶向信号通路磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（P13K／AkCmTOR）的影响。方敞用不同浓度的雷帕霉素（10、15、20μmol／L）处理SH-SY5Y细胞（雷帕霉素干预组）,以加入相同体积二甲基亚砜（DMSO）的SH-SY5Y细胞作为阴性对照组,设立空白对照组。CCK．8法测定细胞生长率;采用流式细胞仪检测细胞周期,通过AnnexinV-FITC／PI双染法检测细胞凋亡率;Westernblotting检测easpase-3剪切体及P13K／Akt/mTOR信号通路上下游分子PDKp85、Akt、mTOR、4E-BPl表达及其磷酸化水平的变化。结果与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组细胞生长率显著降低（P〈0．05或P〈0．01）;G。／G,期细胞百分比显著增高（P〈0．05）;细胞凋亡率显著升高（P〈0．01）。Westernblotting检测结果显示：与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组easpase-3剪切体表达水平较高;P13K／Akt/mTOR信号通路上下游分子的活性均被抑制,P13Kp85、Akt、mTOR、4E-BP1的磷酸化水平均明显降低。结论雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y具有抑制生长和诱导凋亡的作用,其机制可能与抑制P13K／Akt/mTOR信号通路有关。     

雷帕霉素抑制肝癌细胞生长及转移的实验研究

目的探讨具有抗肿瘤特性的新型免疫抑制剂雷帕霉素(RPM)对肝癌细胞生长及转移的作用。方法应用流式细胞仪检测RPM(10 ng/m l)、环孢素(CsA)(100 ng/m l)、以及两者合用对人肝癌高转移细胞株MHCC97H细胞凋亡及细胞周期的影响;应用MTT法检测上述药物对细胞增殖的影响。用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测RPM处理后血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA、缺氧诱导因子-1α(H IF-1α)mRNA、转化生长因子b(TGFb)的表达。ELISA法检测MHCC97H培养液上清VEGF蛋白水平的变化。28只原位种植高转移性人肝癌模型LC I-D20裸鼠,随机分为CsA(25 mg/kg)组、RPM(2 mg/kg)组、CsA+RPM组及对照组(生理盐水),每组7只;探讨免疫抑制剂对肿瘤生长及自发肺转移的影响。结果体外实验中,RPM抑制了MHCC97H细胞的增殖,并使细胞停滞于G0/G1期,但未促进细胞凋亡。RPM下调了H IF-1α和VEGF的基因表达及MHCC97H培养液上清VEGF蛋白的表达(890.3 pg/m l±25.1 pg/m lvs 1583.7 pg/m l±17.3 pg/m l,P=0.000)。CsA对细胞周期及增殖无影响。体内实验中,RPM及CsA+RPM抑制了LC I-D20模型移植瘤的生长(0.76 g±0.38 g vs 2.09 g±0.75 g,P=0.001;0.40 g±0.22 g vs 2.09 g±0.75 g,P=0.000)及肺部转移的发生(均为2/7 vs 7/7,P=0.021)。CsA组肺部自发转移灶的数目多于对照组(6±2 vs 4±1,P=0.046)。结论RPM能明显抑制肝癌细胞的生长及转移,以RPM为基础的免疫抑制方案在肝癌肝移植中可能有临床应用前景。     

RAD001对胃癌SGC7901细胞生长的抑制作用及分子机制

目的:研究mTOR特异性抑制剂RAD001对胃癌SGC7901细胞增殖的影响,并探讨survivin在其中的作用.方法:常规培养胃癌SGC7901细胞,RAD001单独或联合顺铂干预,MTT法测定RAD001对胃癌SGC7901细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率.免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用...     

4E-BP1?p70S6K 在RAD001 抑制胃癌MKN-28?N-87细胞生长中作用的实验研究

目的:探讨真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)、核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶p70S6K在RAD001抑制胃癌MKN-28、N-87细胞生长中的作用.方法:体外培养人胃癌MKN-28、N-87细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术、Westem-blot检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布及p70S6k、4E-BP1蛋白表达及磷酸化情况.结果:细胞计数结果显示RAD001作用于胃癌细胞株MKN-28,N-87 24 h即开始出现对细胞生长的抑制作用,随着作用时间延长至48、72 h,抑制作用逐渐增强.流式细胞术结果显示RAD001作用24 h后MKN-28、N-87细胞株细胞周期发生改变,停滞在G0～G1期细胞比例增加,在实验中显示细胞系N87对于RAD001作用相对敏感.Western-blot结果显示RAD001作用24 h后MKN-28、N-87的4E-BP1和p70S6K表达下降,同时去磷酸化.结论:RAD001是通过抑制mTOR的活性,进而阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节着细胞周期以发挥抑制胃癌细胞生长的作用.     

CIK、DC-CIK细胞杀伤胃癌MKN-28细胞的作用比较

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后对胃癌MKN-28细胞株的杀伤作用。方法取正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,共培养成DC-CIK细胞,以MTS法测定不同组CIK细胞对MKN-28杀伤活性。结果与单纯CIK细胞相比较,DC-CIK组细胞增殖速率明显提高(P<0.05);具有更强的杀伤胃癌MKN-28细胞株的活性(P<0.05),效靶比为20.0∶1时,DC-CIK组对MKN-28的杀伤活性为(38.02±2.06)%,>CIK组的(29.78±1.84)%,差异有统计学意义。结论 DC-CIK细胞是一种增殖活性和细胞毒作用均高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。     

microRNA-137对人胃癌MKN-45细胞迁移侵袭的影响

目的 研究miR-137 过表达对人胃癌MKN-45 细胞迁移侵袭的影响. 方法 采用RT-PCR法检测5 株胃癌细胞和人胃黏膜上皮细胞( GES )中 miR-137 的表达. 构建miR-137慢病毒,并转染MKN-45细胞. 通过划痕实验、细胞侵袭小室检测和Transwell侵袭实验以分析过表达miR-137对MKN-45细胞迁移侵袭的影响. 结果 MKN-45 细胞中miR-137的表达丰度明显低于在 GES、MKN-74、AGS、SGC-7901和BGC-823细胞,差异有统计学意义(P<0. 05). 同时成功构建micro up病毒感染的细胞组. 划痕实验结果显示,与空白对照组( CON组)和阴性对照组( NC组)比较, micro up组24、48 h后平均迁移率差异有统计学意义( P<0. 05 );细胞侵袭小室检测结果显示,与 CON组、NC组比较, micro up组的平均迁移率差异有统计学意义( P<0. 01 );Transwell侵袭实验结果显示,与CON组、NC组比较,micro up组平均迁移率差异有统计学意义( P<0. 01 ). 结论 miR-137过表达能明显抑制人胃癌MKN-45细胞迁移侵袭能力,有可能成为胃癌治疗的新靶点.     

虫草素抑制人胃癌细胞MKN-28运动侵袭能力研究

[目的]探讨虫草素对人胃癌细胞MKN-28体外迁移、侵袭能力的影响及其可能作用的分子机制。[方法]CCK8法检测虫草素对MKN-28细胞的增殖抑制作用,体外迁移、侵袭实验观察虫草素对人胃癌细胞MKN-28迁移、侵袭能力的影响,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测虫草素作用24 h后MKN-28细胞Ezrin蛋白,基质金属蛋白9(MMP9)信使核糖核酸(mRNA)表达变化。[结果]200~800μg/mL虫草素可明显抑制MKN-28胃癌细胞增殖,体外迁移实验显示虫草素组细胞划痕闭合约18%,对照组细胞划痕闭合约25%,而表皮生长因子(EGF)组闭合约48%。虫草素组显著低于另两组(P0.05)。体外侵袭实验结果表明虫草素组穿过人工基底膜的细胞数明显减少(P0.05);虫草素组Ezrin和MMP9的表达明显下调(P0.05)。[结论]虫草素可能通过下调Ezrin及MMP9表达抑制人胃癌细胞MKN-28细胞的迁移与侵袭能力,从而发挥其抑制肿瘤生长的作用。     

干扰CTPS基因促进川楝素诱导的人胃癌MKN-45细胞凋亡

目的 探讨干扰CTPS基因对川楝素诱导的胃癌MKN-45细胞凋亡的影响。方法 通过生物信息学分析CTPS基因在人胃癌组织中的表达情况以及CTPS基因高表达的胃癌患者的总生存期。以人胃癌MKN-45细胞为实验材料,构建CTPS基因干扰载体,转染MKN-45细胞48 h后,采用qRT-PCR和Western blot检测CTPS基因mRNA和蛋白表达情况。用80 nmol/L的川楝素处理干扰CTPS基因的MKN-45细胞48 h,使用MTT实验法检测细胞存活率,激光共聚焦显微镜观察细胞形态,免疫荧光法检测γH2AX的表达。结果 生物信息学分析发现CTPS在人胃癌组织中高表达,CTPS基因高表达的胃癌患者总生存期短。向MKN-45细胞中分别转染Sh-ctrl空载体和Sh-CTPS干扰载体,qRT-PCR和Western blot检测显示,与转染Sh-ctrl空载体相比,转 染Sh-CTPS干扰载体的MKN-45细胞中CTPS mRNA和蛋白表达均降低,其中转染ShCTPS-3干扰效果最显著,分别降低了85.21%和53%（P<0.001）。检测细胞存活率及形态变化显示,与Sh-ctrl组相比,ShCTPS-3组细胞存活率降低（P<0.01）,细胞皱缩,形态不规则,呈现凋亡特征,细胞凋亡率升高（P<0.05）;在此基础上用80 nmol/L的川楝素处理转染Sh-ctrl和ShCTPS-3的MKN-45细胞48 h,与Sh-ctrl+川楝素组相比,ShCTPS-3+川楝素组细胞存活率降低（P<0.001）,细胞出现凋亡小体,细胞凋亡率升高（P<0.05）。结论 干扰CTPS基因促进川楝素诱导的胃癌MKN-45细胞凋亡。     

依维莫司和LBH589对耐药急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及多药耐药相关蛋白表达的影响

目的 探讨雷帕霉素衍生物依维莫司(RAD001)或联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对耐药急性髓系白血病细胞株HL-60/ADM细胞增殖、凋亡和逆转耐药的影响.方法 采用不同浓度RAD001或联合LBH589处理HL-60/ADM细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活力,Hoechst33342染色法和AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡、阿霉素摄取率和多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达评估逆转耐药效应.进一步检测处理前后细胞信号通路蛋白变化,探讨其机制.结果 10～50 μmol/L RAD001均能够抑制HL-60/ADM细胞增殖、诱导凋亡,在作用48和72 h时30 μmol/L药物浓度达到最大抑制效果,进一步增加药物浓度细胞增殖抑制率并没有明显增加(P＜0.05).不同浓度RAD001和LBH589联合处理HL-60/ADM细胞,没有明显的协同抑制增殖作用[协同指数(CI)≥1.0].10 μmol/LRAD001处理HL-60/ADM细胞可以明显下调细胞表面MRP1表达(93.90%±4.20%比79.10%±3.28%,P＜0.05),提高HL-60/ADM细胞阿霉索蓄积率(8.53%±0.68%比15.37%±1.46%,P＜0.01).深入机制研究表明,RAD001可以阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,通过上调P53抑制MRP1蛋白的活性.结论 RAD001与LBH589联合没有协同抑制HL-60/ADM细胞增殖作用.但RAD001单药能够有效抑制HL-60/ADM细胞增殖,诱导凋亡,通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞MRP1蛋白的表达,提高细胞阿霉素摄取率而逆转耐药.

Abstract：

Objective To investigate the effects of everolimus ( RAD001 ) or plus panobinostat (LBH589) on the proliferation, apoptosis and drug resistance in chemoresistant acute myeloid leukemic cells.Methods HL-60/ADM cells were treated with RAD001 alone or with LBH589.Proliferation and apoptosis were evaluated by 3-( 4, 5 ) -dimethylthiahiazo ( -z-y1 )-3, 5-di-phenytetrazoliumromide ( MTT )assay, Hoechst33342 and AnnexinV-FTTC/PI stain.The altered expressions of multidrug resistance-associated protein 1 ( MRP1 ) and intercellular adriamycin accumulation were analyzed by flow cytometry.The change in protein level was analyzed by Western blot.Results Effective proliferative inhibition and apoptotic induction in HL60/ADM cells were observed in the treatment of 10 -50 μmol/L RAD001.The maximal effect was shown for the concentration of 30 μmol/L RAD001 at 48 and 72 hours.The inhibition ratio remained unchanged with the adjustment of drug doses (P ＜0.05).Moreover, there was no synergistic effects in the treatment with different concentration of RAD001 and LBH589 (CI ≥ 1.0).A down-regulation of MRP1 (93.9% ±4.2% vs 79.10% ± 3.28% ) and an up-regulation of adriamycin ( 8.53% ± 0.68% vs 15.37% ± 1.46% ) were induced by the treatment with 10 μmol/L RAD001 ( both P ＜ 0.01 ).RAD001 inhibited the p53-dependent expression of MRP1 via an inhibition of phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT/mTOR signaling pathway.Conclusion The combined treatment of RAD001 and LBH589 has no synergistically inhibitory effect on HL60/ADM cells.But the sole treatment of RAD001 may inhibit proliferation, induce apoptosis and accumulate intercellular adriamycin through a down-regulated expression of MRP1 in HL60/ADM cells via an inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.     

非类固醇类消炎药对胃癌细胞形态学及蛋白表达的影响

目的观察3种非类固醇类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)阿司匹林、消炎痛、NS-398对人胃低分化腺癌细胞株MKN-45的影响,探讨非类固醇类消炎药预防胃癌的机制.方法采用光镜、电镜、免疫细胞化学等技术,研究NSAIDs对胃癌细胞MKN-45的形态学变化以及对COX-1,2、hMLH1、hMSH2蛋白表达的影响.结果不同NSAIDs对细胞形态的影响不同.扫描电镜检查发现MKN-45细胞表面的分泌泡有脱失现象.免疫细胞化学研究发现正常MKN-45细胞COX-2、 hMLH1、hMSH2表达,COX-1不表达.30μmol/L NS-398作用于MKN-45细胞后COX-2表达缺失.结论 COX-2选择性抑制剂NS-398在一定浓度可以抑制COX-2表达,对治疗胃癌有一定作用.