抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定

目的　构建大容量噬菌体单链抗体库 ,从中筛选人源单链抗体 (ScFv)。方法　从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞 ,用RT PCR扩增轻链可变区基因 (VL)和重链可变区基因(VH) ,通过重叠PCR法将VH 和VL 拼接形成ScFv基因 ,并克隆入噬菌体表达载体PDF ,得到ScFv初级噬菌体抗体库。以高MOI超感染cre 菌株BS136 5 ,通过loxp cre定位重组系统 ,介导轻重链的组合配对 ,得到大容量抗体库 ,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛 ,鉴定抗体库的性能。结果　获得了 6×10 10 的大容量单链噬菌体抗体库。分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF α、地高辛等6种抗原进行筛选 ,均得到多样性的特异性噬菌体抗体。结论　经loxp cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库 ,初步尝试对 6种抗原进行筛选均获成功 ,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体     

大容量人源噬菌体抗体库的构建

目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库。以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体。结果:经超感染重组,得到1·2×1010的大容量抗体库。经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody。结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库。     

鼠抗寻常性天疱疮抗原噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :应用重组噬菌体抗体库技术制备抗寻常性天疱疮抗原 (PVA)的单链抗体。方法 :用PVA免疫小鼠 6w后 ,抽取小鼠脾脏细胞RNA ,逆转录为cDNA。设计针对小鼠抗体重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)的特异性引物 ,PCR扩增出VH 和VL 片段。用带有VH3′端、连接肽和VL5′端序列的引物修饰VL 得VL′后 ,与VH 进行重叠延伸拼接 (splicingbyoverlapex tension ,SOE) ,连接成VH—Linker—VL(ScFv) ,并大量扩增。此ScFv经限制性内切酶Sfi1和Not1酶切后 ,以噬粒pCANTAB 5E为载体 ,构建重组质粒 ,转导TG1 感受态菌 ,建成库容为 1 5× 10 6 的噬菌体抗体库 ,用PVA筛库。结果 :构建了抗PVA的特异性单链抗体库 ,筛选出一高丰度表达单链抗PVA抗体的细胞株。结论 :从小鼠噬菌体抗体库中获得特异性的、单克隆的、单链抗PVA噬菌体抗体     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

中和抗肾小球基底膜抗体的单链抗体的筛选与鉴定

目的 制备人抗肾小球基底膜(GBM)抗体的特异性人源化单链可变区抗体.方法 采用噬菌体表面展示技术,获得一个与人抗GBM抗体结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对该克隆进行DNA序列测定分析.结果 对噬菌体单链可变区抗体库经过3轮筛选后,与第1轮相比富集了137倍.噬菌体抗体与人抗GBM抗体的结合活性其中有35株克隆ELISA的吸光度较高.对这些噬菌体抗体进行交叉反应后,确定其中有10株交叉反应较弱.确定1株(C31)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,大小为750 bp,并符合人源化单链可变区抗体的序列结构.结论 应用噬菌体展示技术成功获得人-抗GBM抗体的单链可变区抗体基因,为临床上治疗Goodpasture综合征奠定实验基础.     

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。     

人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

目的 研制人源抗EV71病毒基因工程抗体.方法 采集多个患儿外周血淋巴细胞,构建人源抗EV71单链（scFv）噬菌体抗体基因文库.用纯化的EV71 VPI蛋白对抗体库进行筛选,将筛出抗体的轻链和重链通过序列测定确定抗体轻重链型别后分别克隆入全抗体表达载体pAC-LCH3R后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功地获得了1株抗EV71病毒VPI蛋白的人源单克隆抗体,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,表达成分泌型IgG全抗体在体外与A型及C4亚型EV71病毒的中和反应结果 显示为阴性.结论 从免疫库中获得了1株人源非中和单抗,为EV71病毒引起的手足口病的鉴别诊断奠定了基础.     

人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选

目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库, 从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv), 并对其特异性进行鉴定.方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库.对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选, 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序.结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库.对抗体库进行3轮正负淘选和富集后, 随机挑取2 798个克隆进行ELISA, 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应, 而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应.对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定, 结果与ELISA一致.免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义.结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库.通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆, 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.     

全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定

目的鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位。方法从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主E.coli Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性。结果 huIFN-α1b蛋白在E.coli Rosseta(DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平。结论 huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位。     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

The antibody site in Atlantic salmon; phage display and modeling of scFv with anti-hapten binding ability.

Cloning and sequencing the cDNA of around 50 VH (VDJ) and 15 VL genes in Atlantic salmon demonstrated nine VH families (above 80% identity within each family) and one dominating but relatively diverse VL family in this species. The highest variability of the VH was seen in the CDR3, but CDR2 also expressed a modest variability. The 'whole' antibody repertoire was expressed as single chain Fv (scFv) in a phage display library by combining 12 VH and two VL specific primers (FR1/microl and FR1/CL, respectively). The PCR products (VH and VL) were ligated (with a G-rich spacer) into the lambda Surf-Zap (Stratagene) vector and expressed as a surface fusion protein on the M13 phage. Anti-TNP and anti-FITC specific scFv clones were isolated by panning using hapten-coated magnetic beads and the coding DNA sequenced. The specificities of the anti-TNP and anti-FITC clones were similar to mouse monoclonal antibodies. 3D-models of the active sites (CDRs) of the anti-TNP and anti-FITC clones suggest hapten-interacting structures of the salmon antibody site similar to mammalian antibodies.     

Single-chain variable fragment (scFv) antibodies against rotavirus NSP4 enterotoxin generated by phage display

The rotavirus non-structural NSP4 protein causes membrane destabilization as well as an increase in intracellular calcium levels in eukaryotic cells and induces diarrhea in young mice, acting as a viral enterotoxin. In this study the phage display technique was used to generate a panel of single-chain variable fragment (scFv) antibodies specific for the NSP4 protein of the human rotavirus strain Wa from a human semi-synthetic scFv library. After several rounds of panning and selection on NSP4 adsorbed to polystyrene tubes, individual scFv were isolated and characterised by fingerprinting and by sequencing the VH and VL genes. The isolated scFv antibodies specifically recognize NSP4 in enzyme immunoassay and in Western blot. Four truncated forms of the NSP4 protein were constructed which allowed us to map the binding region of the selected scFv antibodies to the C-terminal portion of NSP4. The isolated scFv antibodies constitute valuable tools to analyse the mechanisms of NSP4 functions.     

人源抗狂犬病毒基因工程单链抗体的研究

目的 研制人源抗狂犬病毒基因工程抗体.方法 从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者采集外周血淋巴细胞,通过pHAL14载体和高效噬菌体系统构建人源抗狂犬病毒单链基因工程抗体库,经纯化的狂犬病毒aG株富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果 成功地获得了6株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆抗体,非竞争ELISA显示6株抗体具有较高的亲和力,体外中和试验证实这6株人源单抗对狂犬病毒CVS株无中和活性,对aG株具有较强的中和活性.结论 从免疫库中获得了6株人源单克隆抗体,为狂犬病毒的鉴别诊断和治疗奠定了基础.