VEGF反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

目的:探讨VEGF反义寡核苷酸转染对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法:运用Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌(GBC-SD)细胞。采用MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率,流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果:SODN组、SODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长无显著影响(P>0.05),ASODN组及ASODN十Oligofectamine组则能显著抑制GBC-SD细胞生长(P<0.05),且ASODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN十Oligofectamine组能促进GBC-SD细胞凋亡(P<0.05)。结论:VEGFASODN转染能抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长和增殖,Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。     

反义血管内皮生长因子(VEGF)转染体内抑制胆囊癌VEGF及其受体表达的研究

目的:探讨Oligofectamine介导的血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胆囊癌GBC-SD细胞裸鼠移植瘤的生长及VEGF、Flt-1和KDR表达的影响。方法:通过裸鼠皮下接种体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型,并将裸鼠分为对照组(A组)、VEGF SODN Oligifectamine组(B组)和VEGF ASODN Oligifectamine组(C组),各组裸鼠在接种后24h内,在接种部位皮下分别缓慢注射200μl磷酸缓冲液(PBS)、VEGF SODN100μg Oligofectamine0.5μl(总体积为200μl)及VEGF ASODN100μg Oligofectamine0.5μl(总体积为200μl),每3天1次,连续治疗5周,观察各组裸鼠的成瘤性、体积及瘤重的变化,并运用免疫组化技术检测胆囊癌裸鼠移植瘤中VEGF、Flt-1和KDR的表达变化。结果:A、B、C组裸鼠2周时的成瘤率分别为87.5%、87.5%和37.5%,C组显著低于A、B组(P<0.05),5周时各组的成瘤率均为100%。各组裸鼠移植瘤5周时的体积和瘤重分别为:A组(253.49±27.11)mm3和(1.96±0.17)g,B组(255.84±26.51)mm3和(1.86±0.21)g,C组(125.45±17.49)mm3和(0.97±0.13)g,C组显著低于A、B组(P<0.05),C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。A、B组裸鼠移植瘤VEGF、Flt-1和KDR的表达均无统计学差异(P>0.05),而C组裸鼠移植瘤VEGF、Flt-1和KDR的表达较A、B组明显减弱(P<0.05)。结论:VEGF ASODN在体内能显著抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的增殖,降低其在裸鼠体内的成瘤性,抑制VEGF、Flt-1和KDR在蛋白水平的表达,抑制裸鼠移植瘤的生长及血管的形成。     

联合应用Survivin和VEGF反义寡核苷酸对肺癌A549细胞的抑制作用

目的研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞经Survivin和VEGF反义寡核苷酸(ASODN)单独和联合转染后细胞生长、凋亡以及对基因表达的抑制作用。方法针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸,以脂质体(Lip)为载体,介导Survivin和VEGF ASODN单独和联合转染A549细胞。MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测细胞中Survivin和VEGF基因的mRNA含量,流式细胞术检测细胞凋亡以及细胞中Survivin基因的蛋白表达。结果经脂质体转染后200~600 nmol/L Survivin ASODN和5~20μmol/L VEGF ASODN均能抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡;在48 h时,400 nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN抑制率和凋亡率有统计学意义(P<0.05);两者联合转染A549细胞抑制率和凋亡率分别为(61.37±1.94)%和57.03%,显著高于两基因单独转染(P<0.05);联合组的Survivin mRNA的表达量为(15.26±1.31)%,蛋白表达率为(30.40±1.33)%,VEGF mRNA的表达量为(13.12±1.45)%,均显著低于单独转染组(P<0.05)。结论 Survivin和VEGF ASODN均能抑制A549细胞基因表达,诱导细胞凋亡,两基因反义寡核苷酸联合转染的效果优于单独转染。     

VEGF—C对胰腺癌细胞凋亡影响的实验研究

目的研究VEGF—C对胰腺癌细胞凋亡的影响。方法建立人胰腺癌细胞株PANC-1裸鼠原位种植瘤模型,原代培养原发和淋巴结转移灶中胰腺癌细胞,通过VEGF—C反义寡核苷酸体外转染抑制其表达,应用RT—PCR及流式细胞术等方法研究对淋巴结转移胰腺癌细胞凋亡及bcl-2的影响。结果体外转染后,原代培养原发和淋巴结转移灶中PANC-1胰腺癌细胞VEGF—C的mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）。体外转染VEGF—C反义寡核苷酸抑制其表达后,对照组、SODN组、ASODN组淋巴结转移胰腺癌细胞的凋亡率为（2．83±1．01）％、（4．98±2．05）％、（13．22±2．17）％,ASODN组细胞凋亡率显著提高（P〈0．01）,而原发灶胰腺癌细胞的凋亡率分别为（3．51±1．38）％、（4．79±2．16）％、（5．33±2．18）％,凋亡率无明显影响（P〉0．05）;淋巴结转移胰腺癌细胞的反义组bcl-2表达水平明显下调（P〈0．05）,而原发灶胰腺癌细胞bcl-2表达水平无明显变化（P〉0．05）。结论抑制淋巴结转移灶中胰腺癌细胞VEGF—C的高表达可促进胰腺癌细胞凋亡,这和bcl-2表达下调有关;但对原发灶胰腺癌细胞无明显影响。     

KDR反义寡核苷酸对人前列腺癌PC-3细胞增殖调控的研究

目的探讨血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain-containing receptor,KDR)反义寡核苷酸(antisense oligode-oxynucleotides,ASODN)对人前列腺癌PC-3细胞的增殖调控作用。方法设计并合成KDR的正义、反义寡核苷酸,经脂质体介导转染人前列腺癌PC-3细胞。用噻唑盐法观察不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)正义、反义寡核苷酸及阳离子脂质体对肿瘤细胞增殖的抑制作用,RT-PCR方法检测不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)ASODN转染后KDRmRNA的表达情况,流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡。结果转染ASODN后48 h达抑制高峰,低浓度(0.01μmol/L)即发生抑制,抑制强度与反义寡核苷酸浓度有相关性,而正义寡核苷酸和阳离子脂质体对PC-3细胞的增殖无显著影响。转染KDR反义寡核苷酸各浓度组细胞中KDR mRNA的表达都不同程度地降低,各浓度组与空白对照组相比KDR mRNA表达的差异有统计学意义。各组均出现不同程度的细胞凋亡,但各浓度组间细胞周期分布无显著性差异。结论 KDR基因在促进人前列腺癌PC-3细胞增殖中发挥着一定的作用,有望成为治疗雄激素非依赖性前列腺癌的分子靶点。     

选择性环氧合酶-2抑制剂Celebrex对人胆囊癌GBC-SD细胞系VEGF表达的影响

目的探讨选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂Celebrex对人胆囊癌GBC-SD细胞系血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用RT-PCR、免疫细胞化学技术以及Western blot联合检测Celebrex对GBC-SD细胞系VEGF mRNA和蛋白表达的影响,并观察量效和时效关系。结果随着药物浓度的增加（0、40、80、120、160μmol/L）和作用时间的延长（0、12、24、48、72h）,VEGF mRNA和蛋白表达均呈现出了相应的下降趋势。结论Celebrex可以有效地抑制人胆囊癌GBC-SD细胞系VEGF的表达。     

Survivin与VEGF基因反义寡核苷酸联合应用人肺腺癌A549细胞作用研究

目的：探讨脂质体介导的血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）与生存素（Survivin）基因反义寡核苷酸联合应用对人肺腺癌细胞系A549生长的影响。方法：构建 VEGF 与 Survivin基因反义寡核苷酸,以脂质体转染人肺腺癌A549细胞。实验分为对照组、脂质体对照组、VEGF反义转染组（VEGF ASODN组）、Survivin反义转染组（Survivin ASODN组）、联合转染组（VEGF ASODN+Survivin ASODN组）。采用RT-PCR检测VEGF与Survivin基因表达;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡、检测VEGF与Survivin蛋白表达;MTT观测细胞生长;平板集落实验分析细胞增殖克隆能力。结果：脂质体介导的VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合转染组A549细胞存活率和增殖克隆能力明显低于其余组,差异有统计学意义（P=0.043,P=0.049,P=0.038,P=0.023）。流式细胞仪分析显示联合转染组细胞周期被阻滞,Survivin蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.017,P=0.002）,VEGF蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.013,P=0.003）。RT-PCR检测结果显示联合转染组VEGF与Survivin基因表达低于其余组。结论：VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合应用抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,延长细胞周期,抑制 VEGF与Survivin基因表达。为后续的动物实验打下了理论依据。     

KDR反义寡核苷酸对人胃癌细胞的作用

目的　用 KDR反义寡核苷酸作用于人胃腺癌细胞 ,观察对细胞增殖及超微结构的影响 ,检测作用后 KDR基因的表达 ,并测定细胞分泌 VEGF的能力 .方法　 MTT法测定细胞的增殖能力 ,电镜下观察细胞的超微结构 .原位杂交及免疫组化法检测 KDR m RNA及蛋白的表达 .ELISA法测细胞培养液中人 VEGF的含量 .结果　 KDR ASODN可明显的抑制人胃腺癌细胞增殖 .增殖抑制率最高可达 55.4% .当剂量为 2 0μmol· L-1 时还可诱发细胞凋亡 .KDR ASODN能明显抑制细胞内 KDR m RNA和蛋白的表达 .胃癌细胞还能分泌一定量的人 VEGF:(92± 1 .7) ng· L-1 .结论　胃癌细胞能分泌一定量的人 VEGF.KDR ASODN能抑制细胞内 KDR基因的表达 ,并显著抑制胃癌细胞的增殖 .在一定剂量下还可诱发其凋亡 .说明 VEGF及受体 KDR在人胃腺癌细胞的增殖、凋亡的调控中起重要作用     

脂质体介导反义核苷酸转染骨肉瘤细胞后Survivin与VEGF表达的相互影响

目的探讨脂质体介导Survivin与VEGF反义核苷酸转染骨肉瘤细胞后表达的相互影响。方法分别采用脂质体介导Survivin基因的反义寡核苷酸(ASODN)和VEGF因子的反义寡核苷酸(ASODN)转染骨肉瘤细胞(9607细胞系),空脂质体处理对照组细胞;采用MTT法检测各组细胞的抑制率,RT-PCR法检测各组细胞Survivin和VEGF mRNA的表达。结果9607细胞转染两种ASODN后生长均受到抑制且呈时间依赖性。在Survivin-ASODN组和VEGF-ASODN组9607细胞中,SurvivinmRNA的相对表达量低于对照组;VEGF mRNA的相对表达量也较对照组降低。经统计软件相关分析Survivin-ASODN组Sur-vivin mRNA与VEGF mRNA表达量抑制率的相关系数r=0.602(p=0.038);VEGF-ASODN组中VEGF mRNA与Survivin mR-NA表达量的抑制率相关系数r=0.702(p=0.011)。结论Survivin-ASODN和VEGF-ASODN均能下调骨肉瘤细胞中Survivin和VEGF mRNA的表达,Survivin-ASODN和VEGF-ASODN能够抑制骨肉瘤细胞(9607细胞系)增殖,诱导其调亡。两者的表达具有相关性。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

生存素反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因表达的影响

目的检测生存素(survivin)反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因及蛋白表达的影响。方法将生存素反义寡核苷酸(ASODN)分为150、500和1000nmol/L3个不同浓度的亚组对SMMC-7721细胞进行转染,并设正义寡核苷酸(SODN)组、空脂质体组及空白组作为对照组。采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组中生存素mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)检测各组中生存素蛋白的表达。结果各ASODN亚组生存素mRNA及生存素蛋白的表达量均低于各对照组(P<0.05或P<0.01)。各ASODN亚组间比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),并呈现剂量依赖性。SODN组、空脂质体组及空白组组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用生存素反义寡核苷酸转染SMMC-7721细胞,可以下调生存素mRNA及其蛋白的表达。     

奥曲肽对人胆囊癌细胞VEGF表达的影响

目的：探讨奥曲肽在体外对人胆囊癌细胞VEGF表达的影响。方法：体外培养人胆囊癌细胞株GBC—SD，用RT-PCR法检测VEGFmRNA水平，用ELISA法检测培养液上清中的VEGF蛋白水平。结果：GBC-SD高水平表达VEGF；经奥曲肽作用后，VEGFmRNA／β-actin相对系数显著下降，呈剂量依赖效应；奥曲肽也显著降低培养上清液中的VEGF浓度，抑制作用随时间延长和奥曲肽剂量增加而增大。结论：奥曲肽能下调GBC—SD的VEGF的mRNA和蛋白表达水平。     

非黑色素性皮肤癌组织中血管内皮生长因子及其受体1和受体2的表达

目的:检测皮肤鳞状细胞癌(SCC)和基底细胞癌(BCC)组织中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体1(Flt-1)、受体2(KDR)的表达。方法:应用免疫组化SP法检测26例皮肤SCC、18例BCC组织中VEGF、Flt-1和KDR的表达。取10例正常皮肤组织标本作对照。结果:皮肤SCC、BCC和正常皮肤组织中VEGF的表达水平分别为(129.05±9.93)、(119.40±9.37)及(85.25±12.98),Flt-1的表达水平分别为(130.48±12.02)、(116.90±13.45)及(82.19±9.15),KDR的表达水平分别为(136.60±6.67)、(120.95±6.33)和(85.43±9.33),3组间VEGF、Flt-1和KDR蛋白的表达差异均有统计学意义(F分别为83.418、78.137和169.125,P均<0.001)。皮肤SCC组织中VEGF与Flt-1(r=0.773,P<0.001)、VEGF与KDR(r=0.676,P<0.001)、Flt-1与KDR(r=0.718,P<0.001)的表达均呈正相关。结论:VEGF及其受体的过表达可能与非黑色素性皮肤癌的发生有关。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肝星状细胞胶原表达的影响

目的:观察结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸对肝星状细胞株(HSC-T6)前胶原α2(Ⅰ)表达的影响。方法:实验分为反义寡核苷酸(ASODN)组、正义寡核苷酸(SODN)组、脂质体对照组、空白对照组。除空白对照组外,其余各组均于转导前提前加入TGF-β1因子刺激。结果:ASODN能显著抑制经TGF-β1活化后的HSC-T6前胶原α2(Ⅰ)mRNA的表达,而SODN和脂质体对照组对HSC-T6前胶原α2(Ⅰ)mRNA的表达均无明显影响。结论:前胶原α2(Ⅰ)表达与CTGF密切相关,进一步提示CTGF可能是肝纤维化发生发展的关键介导者;应用反义寡核苷酸封闭CTGF的表达有望成为肝纤维化治疗的一种新手段。     

siRNA沉默MUC16对胆囊癌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨siRNA沉默黏蛋白(mucin,MUC)16基因对人胆囊癌细胞(GBC-SD)增殖和迁移的影响及其分子机制。方法采用慢病毒感染和siRNA干扰技术沉默GBC-SD中MUC16基因(GBC-SD+MUC16-siRNA组),同时设立阴性对照组(GBC-SD+NC组)和空白对照组(GBC-SD组)。RT-PCR检测各组GBC-SD细胞中MUC16表达情况,噻唑蓝实验检测GBC-SD细胞增殖能力,划痕实验检测GBC-SD细胞迁移能力,蛋白免疫印迹实验检测GBC-SD细胞中PCNA和CD44蛋白表达情况。结果GBC-SD+MUC16-siRNA组细胞增殖率和细胞迁移数目均低于GBC-SD组(P < 0.05);GBC-SD+MUC16-siRNA组MUC16、CD44蛋白表达均低于GBC-SD组、GBC-SD+NC组(P < 0.05~P < 0.01),PCNA蛋白表达亦低于GBC-SD+NC组(P < 0.05)。结论siRNA沉默MUC16具有一定的抑制胆囊癌细胞增殖和迁移作用,可为胆囊癌的治疗提供新的实验证据。     

survivin反义寡核苷酸对肝癌耐药细胞的作用及与化疗的关系

目的研究survivin反义寡核苷酸对人肝癌耐药细胞株的增殖和凋亡情况,以及对阿霉素化疗敏感性的影响。方法将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM分为脂质体转染组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染组、正义寡核苷酸转染 阿霉素组、反义寡核苷酸转染组、反义寡核苷酸转染 阿霉素组共6组。MTT法检测细胞相对存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡率变化,RT-PCR和Westernblot印迹法检测细胞survivinmRNA和蛋白表达。结果survivin-ASODN作用后的人肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM的细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。survivinmRNA和survivin蛋白表达:脂质体转染对照组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染对照组、正义寡核苷酸转染对照 阿霉素组之间survivin蛋白表达无明显差异(P>0.05)。400ng/mlsurvivingASODN组和400ng/mlASODN 阿霉素组survivinmRNA较其他4组显著降低(P<0.05),但其两组之间表达无明显差异(P>0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能降低肝癌耐药细胞survivin表达,增强人肝癌耐药细胞对阿霉素的化疗敏感性。     

5-ALA治疗和hTERT mRNA的反义寡核苷酸联合应用对人卵巢癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：观察5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力治疗（PDT）和人端粒酶催化亚单位 (hTERT) mRNA的反义寡核苷酸（ASODN)联合应用对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制及促凋亡作用,探讨两种方法联合应用协同促进对人卵巢癌3AO细胞的杀伤作用机制。方法：采用MTT法筛选不同浓度5-ALA 和激光能量照射对人卵巢癌3AO细胞增殖抑制作用的最佳组合参数; RT-PCR法检测hTERT ASODN和SODN转染后hTERT mRNA表达水平的变化。将人卵巢癌3AO细胞分为空白
对照组、hTERT ASODN转染组、hTERT SODN转染组、5-ALA PDT组、hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组和hTERT SODN转染+5-ALA PDT组,应用MTT法检测各组人卵巢癌3AO细胞增殖抑制率;应用膜联蛋白V-硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)双染色结合流式细胞术检测
各组人卵巢癌3AO细胞凋亡率。结果：5-ALA PDT对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用随着光敏剂浓度的增加和激光能量的增大而增加(P<0.05);不同浓度hTERT ASODN转染人卵巢癌3AO细胞24 h后,hTERT mRNA表达水平呈浓度依赖性下调(P<0.05),而hTERT-SODN对人卵巢癌3AO细胞hTERT mRNA表达无显著影响(P>0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT (5-ALA浓度为0.5 mmol•L-1,激光能量密度为2.50 J•cm-2)组人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制率高于5-ALA PDT组和hTERT ASODN组(P<0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组人卵巢癌3AO细胞的凋亡率为29.28％,显著高于hTERT ASODN 转染组（12.79％）和5-ALA PDT组（21.19％)(P<0.05）。结论：hTERT ASODN转染与5-ALA PDT联合治疗可协同增强对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用,其机制可能与联合作用促进细胞凋亡有关联。     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞SKOV3的黏附、侵袭能力的影响

目的:探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C,ASODN)对人卵巢癌细胞SKOV3黏附、侵袭能力的影响.方法:以VEGF-C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染.MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质黏附能力;利用transwell小室,检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力;免疫组化法检测细胞中VEGF-C蛋白表达,western blot检测细胞中MMP-2蛋白表达.结果:与空白对照组及正义序列转染组相比,ASODN组对细胞外基质黏附率明显降低(P＜0.01),穿透重组基质膜数目明显下降(P＜0.01),细胞中VEGF-C、MMP-2蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论:VEGF-C ASODN可明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力,下调MMP-2的表达可能是其作用途径.     

乳香提取物对HL-60细胞株VEGF分泌及其Flt-1受体表达的影响

目的:探索不同浓度乳香提取物作用于HL-60细胞后,白血病细胞株HL-60细胞VEGF mRNA表达及VEGF蛋白分泌及受体Flt-1的变化.方法:MTT法检测乳香提取物对细胞增殖的抑制作用,选择适当的药物浓度及作用时间:RT-PCR法检测乳香提取物处理前后HL-60细胞中VEGF mRNA表达水平;Western B...