人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达

目的扩增人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础。方法利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果经PCR、酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%。经SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的：获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体，进行核苷酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法：利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经kpnI、BamHI双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因，与GenBank的报道相比较，有1．4％的bp发生变异，1．6％的氨基酸残基改变。其同源性高达98％。结论：成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及初步应用

目的　获取重组表达人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori ,Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位 ,并应用于临床诊断。方法　利用PCR技术扩增HpHspA基因 ,将其构建至PinPointTMXa 3载体中进行诱导表达 ,并对其产物进行SDS PAGE、免疫印迹等检测。同时 ,将纯化的重组蛋白结合ELISA方法对幽门螺杆菌感染患者清除治疗前后血清中的抗HspA抗体进行检测。结果　所克隆的HspADNA由 3 5 4个碱基组成 ,可编码 118个氨基酸残基的多肽 ,SDS PAGE和免疫印迹显示所表达的蛋白分子量约为 14× 10 3 ,并可与相应的抗血清发生特异反应 ;ELISA结果发现 ,消化性溃疡患者在清除治疗后早期只出现明显的抗HspA抗体滴度下降 ,而抗幽门螺杆菌抗体要在治疗后 6月才出现明显下降。结论　重组表达HspA为诊断、预防和治疗幽门螺杆菌的进一步研究奠定了重要实验基础     

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60（Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增Hsp60基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21（DE3）大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果 克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致，Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%，并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别，用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论 Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60(Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法利用PCR技术扩增Hsp60基因,将其定向插入pET-22b(+)载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致,Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%,并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别,用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌与热休克蛋白

幽门螺杆菌是上消化道疾病的主要致病菌，其本身含有热休克蛋白，有两个亚单位——HspA和HspB，可能作为致病因子在幽门螺杆菌感染时发挥作用。幽门螺杆菌感染还可刺激胃粘膜产生一些热休克蛋白，在幽门螺杆菌相关胃疾病中发挥不同的作用，这种机制为Hp-Hsp DNA及蛋白疫苗的研制提供了理论依据，为临床预防和治疗Hp感染开辟了新的途径。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答

目的评价重组热休克蛋白A(rHspA)作为幽门螺杆菌(Hp)口服疫苗成分的效果.方法采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂(霍乱毒素,CT;大肠不耐热肠毒素B亚单位,LTB)共口服免疫BALB/c小鼠,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgA、IgA抗体水平,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN-γ的变化.结果单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组(PBS)相差不显著,而rHspA 佐剂组与对照组相差非常显著.rHspA 佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应;不加佐剂免疫组分泌IFN-γ水平增加,IL-4水平未发现增加;而加佐剂免疫组除IFN-γ水平增加外,IL-4水平也发现显著增加.结论BALB/c小鼠口服rHspA和CT以及LTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

幽门螺杆菌热休克蛋白60脂质体疫苗的制备及其免疫预防作用

OBJECTIVE: To prepare oral liposome-encapsulated recombinant Helicobacter pylori (Hp) heat shock protein 60 (Hsp60) vaccine and investigate its effect against Hp infection in mice. METHODS: The recombinant vector PET-22(+)/Hsp60 was transformed into BL21(DE3) E.coli. The recombinant protein was purified with Ni-NTA agrose resin and the oral liposome-encapsulated vaccine was prepared with phosphatidyl choline and cholesterols using film method, with the size distribution of the folate liposomes measured by transmission electronic microscopy. BALB/c mice were divided into 5 groups and immunized by intragastric administration of PBS, liposome, rHsp60 plus choleratoxin (CT), liposome-encapsulated rHsp60, and liposome-encapsulated rHsp60 plus CT, respectively, given once a week for 4 weeks. All the mice were challenged by Hp for 3 times within two weeks following the last immunization and sacrificed 3 weeks after the last challenge. Hp detection was performed by fast urease test. Semi-quantitative assessment of the bacterial colonization density observation of the inflammation severity and gastric histopathology were carried out. RESULTS: The soluble expression product accounted for 27% of the total bacterial protein. The purity of recombinant fusion protein was about 95% after purification. The mean size of the folate liposomes was 0.7+/-0.4 mum. PBS or liposome alone showed no immune-enhancing effect, and rHsp60 plus CT, liposome-encapsulated rHsp60 and liposome-encapsulated rHsp60 plus CT had the protective rates against Hp infection of 73.3%, 66.7% and 86.7%, respectively. The latter 3 preparations effected significantly reduced Hp infection and alleviated the inflammation in the gastric mucosa of the mice challenged with Hp. CONCLUSION: The oral liposome may serve as a potential adjuvant for Hp vaccine in preventing Hp infection.     

人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建

目的：构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HsPA)和空泡毒素(VacA)编码基因的重组载体，进行核甘酸序列分析，为在E．coliBL21中表达，及其抗原性的研究奠定基础。方法：利用分子克隆技术，扩增HpHspA、VacA编码基因，分别将其与载体pET32a( )进行酶切、连接，同时将筛选的pET32a( )／HspA和pET32a( )／VacA重组载体分别经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切，通过凝胶电泳回收pET32a( )／HspA和VacA片段，经T4连接酶将pET32a( )／HspA和VacA编码基因连接，而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为HpHspA和VacA编码基因，由1080bp组成，与GenBank报道的相比较，有3．4％的碱基发生变异，1．10％的氨基酸残基改变；但编码的蛋白质特性无本质性改变。结论：成功地克隆了HpHspA和VacA编码基因，并构建了能够同时表达HapA和VacA蛋白的双价疫苗重组载体，为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。     

幽门螺杆菌根除治疗的二线方案

目的:研究幽门螺杆菌根除治疗二线方案。方法:通过对近期国内外研究结果回顾总结而找到幽门螺杆菌根除治疗二线方案。结果:通过对近期一些研究结果回顾总结,找到了一些二线方案,仅适应进一步推广及研究。结论:研究出幽门螺杆菌根除治疗二线方案,应具有简单、有效、根除率高(>90%),经济无毒的作用且无药物耐受性。     

幽门螺杆菌感染在残胃黏膜病变中作用的临床观察

目的:通过检测残胃黏膜幽门螺杆菌(Hp)感染,探讨Hp与残胃黏膜病变的关系.方法:对45例胃大部切除的残胃进行胃镜、病理检查和Hp检测,以同期非残胃患者为对照组,进行以上三项的比较.结果:①残胃组和对照组Hp检出率分别为22.2%和60%(P＜0.05).②存在胆汁反流和非胆汁反流患者Hp检出率分别为17.2%和43.8%.(P＜0.05)③胆汁反流发生率,毕罗Ⅱ式手术明显多于毕罗Ⅰ式,分别为46.6%和17.7%(P＜0.05).④残胃黏膜病理,Hp感染和非Hp感染患者有中-重度胃黏膜病变并有异型增生分别为66.7%和21.2%(P＜0.05).对有Hp感染的对照组和残胃组的病理改变无显著差别(p>0.05).结论:Hp感染是残胃炎发生的重要原因.根除Hp有临床意义.毕罗Ⅱ式较毕罗Ⅰ式手术胆汁反流发生高:而伴有胆汁反流者Hp感染率较低.应该综合治疗.     

胃癌中抑癌基因p16表达与幽门螺杆菌感染的关系

目的：分析幽门;螺杆菌（Hp)感染与胃癌发生的关系,探讨Hp感染与抑 基因p16表达水平改变的关系。方法,对57例原发性胃癌,54例慢性胃炎和15例对照组病人常规病理切片HE染色检测Hp感染,原位杂交法检测胃癌及良性病变中p16基因mRNA表达,结果：胃癌组中Hp感染率为49．1％,胃癌,慢性胃炎组Hp感染率与对照组相比差异有显著性（P＜0．05,P＜0．05）,各型胃癌与对照组相比差异都有显著性（P＜0．05）,P16仅在胃癌组织中表达,胃癌组与慢性胃炎组和对照组比较差异有显著性IP＜0．01,P＜0．01）,Hp感染与p16基因过度表达相关（P＜0．01）,结论：Hp感染可能通过促进抑癌基因p16异常表达导致胃癌的发生。     

根除幽门螺杆菌疗法治疗难治性免疫性血小板减少性紫癜

目的观察根除幽门螺杆菌(Hp)疗法对难治性免疫性血小板减少性紫癜(RITP)的疗效。方法对合并Hp感染的19例RITP患者给予除Hp疗法,并比较治疗前后血小板(PLT)计数及血小板自身抗体(PA-IgG)水平。结果①显效2例,良效3例,进步5例,无效9例,有效率52.6%。②与治疗前比较,治疗后PLT数上升,PA-IgG下降(P＜0.05～0.01)。结论根除Hp疗法对部分合并Hp感染的RITP患者有效。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析

目的 获取嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因，并将它克隆到质粒pUC18中进行核苷酸序列分析。方法 应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因，将其定向插入载体pUC18并转化大肠杆菌JM109，用限制性酶切及PCR对重组质粒进行鉴定。用双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定，并与GenBank中报道的HSP60基因进行比较。结果 成功克隆了约1647bp的HSP60基因片段，测序结果表明，所克隆的HSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98％。结论 获得了序列正确的HSP60基因，为其重组表达及相关研究奠定了基础．     

槲皮素对K562/A02细胞株热休克蛋白mRNA及蛋白质表达的影响

目的 了解槲皮素对K562／A02细胞株70kd热休克蛋白(HSP70)基因及蛋白质表达的影响。方法 热处理前后加入终浓度为10μmol／L的槲皮素，RT-PCR方法检测HSP70基因mRNA表达，Western blot方法检测HSP70蛋白表达。结果 热处理明显增加K562／A02细胞HSP70基因mRNA转录和蛋白表达；热处理前加入槲皮素，HSP70基因mRNA及蛋白表达均显著下调；热处理后加入槲皮素，HSP70基因mRNA及蛋白表达无明显变化。结论 热处理能明显增加K562／A02细胞HSP70基因转录和蛋白表达；槲皮素能抑制K562／A02细胞HSP70基因mRNA及蛋白的表达，并且抑制点早于HSP70的基因转录；槲皮素在K562／A02细胞HSP70基因转录启动后则不再有抑制作用。     

幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达

目的　分段扩增、克隆幽门螺杆菌毒素相关基因cag A中间区 cag1,cag2 ,并利用大肠杆菌系统表达 .方法　PCR法扩增 cag A基因 ,双脱氧中止法测序正确后 ,克隆入大肠杆菌表达载体 p BV2 2 0 ,受控于 PRPL 启动子 ,转化大肠杆菌 DH5α,4 2℃进行温度诱导 .结果　 PCR分段扩增出 cag A中间区基因 cag1,cag2 ,分别为 975 ,75 5 bp,克隆入 p UC19质粒 ,测序正确 ;在 p BV中构建 cag1,cag2的重组表达载体p BVcag A1,p BVcag A2 ,工程菌诱导后 SDS- PAGE显示新生表达蛋白带 ,Mr:Cag136× 10 3,Cag2 2 7.9× 10 3,均与预期的 cag A蛋白 Mr一致 ,约占菌体总蛋白的 36 %和 2 4 % .结论　成功克隆分段扩增的 cag A中间区基因 ,并可在大肠杆菌DH5α中高效表达 .