抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

抗人CD25嵌合抗体的稳定表达及鉴定

目的:构建抗人CD25嵌合抗体稳定细胞株,并对表达产物进行相关鉴定。方法:构建CD25嵌合抗体稳定表达质粒VEC-VTacH和3.3-VTacL并稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压选择后扩大培养构建的工程细胞,Protein A纯化回收目的抗体后分别进行质谱分析、蛋白质N端测序和平衡解离常数(Kd)的测定。结果:CD25嵌合抗体稳定细胞株的抗体表达水平约为3.74～7.07μg/ml,质谱分析结果表明其含有鼠源成分和人源成分,蛋白质N端测序表明其与亲本抗体N端序列完全一致,其Kd为2.35×10-10mol/L,而亲本抗体的Kd为1.88×10-10mol/L。结论:抗人CD25嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合活性和亲和力。     

抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达

从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因。通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1。转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%。既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1)。收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量。从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L。经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%。将嵌合抗体(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05)。本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的：构建抗CD71人-鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法：将鼠源性抗CD71单抗(7579)重、轻链可变区基因(VB和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ-Expr和pκ-Expr中；将嵌合表达载体(Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr)经电转染技术共转染至真核细胞(SP2／0)中。结果：经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清，证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区(pγ)和轻链恒定区(Cκ)蛋白；通过间接免疫荧光流式细胞术(FCM)和间接免疫荧光显微技术，证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CC71分子。结论：抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)在体外真核细胞表达成功。     

抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究

目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定。方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因。用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测。结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒。瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力。结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础。     

抗RSV人-鼠嵌合抗体的构建及表达

用RT PCR法克隆抗RSV 鼠单抗4C2 的轻、重链可变区基因, 构建了轻、重链分别表达的载体pAG4622_4C2 和pAH4604 4C2, 及轻、重链同时表达的载体pdHL4C2, 分别转染SP2/0 细胞和DHFR- CHO细胞, 检测培养上清中的嵌合抗体表达。结果在pdHL4C2 转染的CHO 细胞中检测出了可与表达RSVG/F糖蛋白的143TK 细胞结合的人 鼠嵌合抗体     

抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的表达及体外对癌细胞浸润的抑制效应

目的 制备抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体。方法从分泌抗人组织蛋白酶B单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，通过RT-PCR扩增单克隆抗体VH和VL的DNA片段，对其进行序列分析，证实具有小鼠可变区完整的结构，利用基因工程技术将它们分别和人Ig的Cγ1和Ck恒定区基因连接组建人鼠嵌合轻链和重链Fab抗体，并克隆到pcDNA3真核细胞表达载体。将重组体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，通过G418筛选、ELISA检测和Western blot鉴定，分离纯化抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体，用于体外抑制癌细胞浸润的试验。结果得到分泌抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的中国仓鼠卵巢细胞克隆(O62A2)，分泌的抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体在体外能抑制癌细胞浸润。结论人-鼠嵌合抗体的成功表达，将有可能用于组织蛋白酶B过度表达的有关疾病的治疗。     

抗CD4人-鼠嵌合抗体的表达和抗增殖效应

目的：制备抗CD4人－鼠嵌合抗体。方法：从分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，通过RT－PCR扩增出VH和VL的DNA 片优，对VH和VL进行DNA序列测定和分析，证实VH和VL具有小鼠Ig可变区完整的结构功能后，将VH亚克隆至重链表达载体pγ1-Expr,VL亚克隆至轻链表达载体pκ－Expr转化XL2－Blue细菌，通过菌落或质粒PCR筛选阳性克隆，通过电转染将VH－Pγ1，LV－pκ共转染至小鼠骨髓瘤细胞X63Ag8,653，通过G418筛选，ELISA和免疫荧光鉴定。结果：得到分泌抗CD4人－鼠嵌合体的阳性转染瘤细胞克隆。所得到的嵌合抗体在体外对PHA和IL－2诱导的PBMC增殖具有抑制作用。结论：人－鼠嵌合抗体得到成功表达，并有可能作为免疫抑制剂应用于抗移植排斥和自身免疫疾病的治疗。     

抗CEA嵌合小分子抗体的构建与表达

目的 构建表达抗CEA小分子抗体,以利于放射免疫诊断及导向治疗。方法 构建CEA单链抗体基因,克隆入载体pKpL-3a,在大肠杆蓖中包涵体表达,ELISA检测活性,将轻重链基因克隆入分泌型表达载体pSCMH,在大肠杆菌中表达。ELISA检测活性,钭CEA嵌合抗体的轻链和Fd基因克隆入杆状病毒表达载体pAcUW51中,在sf9细胞中分泌表达,ELISA检测活性及测定产量,竞争抑制ELISA测定其识别的抗原表位。结果 多种方法复性的包涵体及原核分泌表达的单链相同的表位。结论 该CEA抗体基因在大肠杆菌中不能表达出有功能的分子。而在昆虫细胞中表达了具自学成才性抗体分子,某些抗体基因只有在真核细胞中才能表达出有功能的抗体分子。     

抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达

目的减少鼠源性单抗的免疫原性,获得抗人血管内皮生长因子１６５（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１６５,ＶＥＧＦ１６５）的人／鼠嵌合抗体。方法 将抗ＶＥＧＦ１６５鼠单抗ＶｍＤ１１鼠单抗ＶｍＤ１１的轻链可变区基因ＶＬ和重链可变区基因ＶＨ分别克隆到带有人ＩｇＧ１轻链恒定区基因ＣＫ,重链恒定区基因Ｃγ１的真核表达载体ｐＡｃｙｃ－ｎｅｏ－Ｃｋ和ｐｓｖ２－Ｃγ１上,构建了真     

抗HBV preS1嵌合抗体的真核表达及活性分析

目的通过真核系统表达抗HBV preS1嵌合抗体4D11并分析其活性。方法通过RT-PCR方法从分泌抗乙型肝炎病毒preS1的鼠源单克隆抗体4D11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)序列,并分别克隆到含有Υ1重链和κ轻链恒定区序列的pcDNA3.1-AH和pcDNA3.1-Ak质粒中,共转染人胚肾细胞变种(293 FT)细胞。通过Western blot、竞争ELISA、阳性血清阻断及血清中preS1的检测实验来分析其活性。结果轻重链基因在细胞内正确组装成嵌合抗体分子并分泌至细胞外,具有结合活性。嵌合抗体可以很好的与病毒preS1结合,对阳性血清的检测效果与鼠单抗一致。结论成功的利用293 FT细胞表达了4D11嵌合抗体,抗体保留了原鼠单抗的特异性和活性,为探讨乙肝抗体的治疗提供了试验资料。     

纤维蛋白单抗SZ—58嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达

为减少鼠源单抗的免疫原性，降低其分子量，应用基因重组技术将纤维蛋白单抗ＳＺ－５８可变区基因与人ＩｇＧ１恒定区基因Ｃ_Ｈ１、Ｃｋ进行拼接、扩增。将扩增后的ＳＺ－５８嵌合Ｆａｂ基因克隆至噬菌体质粒，并导入大肠杆菌中进行表达。表达的嵌合Ｆａｂ片段为可溶性。放免检测其在表达上清中的含量约为２００μｇ／Ｌ，免疫印迹电泳证实ＳＺ－５８嵌合Ｆａｂ片段能特异地与纤维蛋白Ｄ－Ｄｉｍｅｒ结合。