梅毒螺旋体Tp0751重组蛋白的表达及鉴定

目的表达梅毒螺旋体粘附蛋白Tp 0751,纯化表达产物并对其抗原性进行鉴定。方法通过生物信息学分析,去除Tp 0751信号肽序列,构建原核表达体并在大肠埃希菌（E.coli）R2566中进行诱导表达;Ni-NTA法纯化重组蛋白;蛋白质印迹法（WB）鉴定重组蛋白。结果成功构建了PET-28a（＋）/Tp 0751原核表达载体;经表达、纯化后获得了相对分子量约为26 kD的融合蛋白;经WB分析能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论重组表达的Tp 0751重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究Tp 0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定了基础。     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法 PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论 PET-28a(+)表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。     

牛淑会为并列第一作者.梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论PET-28a（+）表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。     

感染依赖性抗原Tp0470的鉴定及在梅毒诊断中的应用

为筛选新型梅毒诊断抗原,以改进梅毒早期诊断及预后判断血清学诊断方法,本研究在鉴定Tp0470蛋白为感染依赖性抗原的基础上,建立基于Tp0470的ELISA方法,检测468份临床血清标本,并与TPPA、LZ-ELISA及RPR结果比较,初步评价该蛋白的诊断价值;同时对Tp0470-ELISA A₄₅₀值与RPR滴度进行相关性分析。结果显示:Tp0470-ELISA的灵敏度和特异度分别为95.32%和95.66%,ROC分析其AUC值为0.907。与TPPA、LZ-ELISA及RPR结果相比,Tp0470-ELISA的符合率分别为95.51%(kappa=0.907)、94.87%(kappa=0.897)、88.67%(kappa=0.771)。Tp0470-ELISA的A₄₅₀值与RPR滴度的相关系数为0.38,P=0.96。以上结果表明基于Tp0470蛋白的ELISA在梅毒血清学诊断中具有较高的潜在应用价值。     

感染依赖性抗原Tp0470的鉴定及在梅毒诊断中的应用

为筛选新型梅毒诊断抗原,以改进梅毒早期诊断及预后判断血清学诊断方法,本研究在鉴定Tp0470蛋白为感染依赖性抗原的基础上,建立基于Tp0470的ELISA方法,检测468份临床血清标本,并与TPPA、LZELISA及RPR结果比较,初步评价该蛋白的诊断价值;同时对Tp0470-ELISA A_(450)值与RPR滴度进行相关性分析。结果显示:Tp0470-ELISA的灵敏度和特异度分别为95. 32%和95. 66%,ROC分析其AUC值为0. 907。与TPPA、LZELISA及RPR结果相比,Tp0470-ELISA的符合率分别为95. 51%(kappa=0. 907)、94. 87%(kappa=0. 897)、88. 67%(kappa=0. 771)。Tp0470-ELISA的A_(450)值与RPR滴度的相关系数为0. 38,P=0. 96。以上结果表明基于Tp0470蛋白的ELISA在梅毒血清学诊断中具有较高的潜在应用价值。     

梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影的构建与鉴定

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)粘附素Tp0751的重组大肠埃希菌菌影(E.coli bacterial ghosts,EBG),为深入评价其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。方法将含有噬菌体PhiX174裂解基因E的质粒pHH43转化E.coli DH5α,42 ℃温控诱导使其形成EBG并计算裂解效率,用琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定EBG。构建含有裂解基因盒E-box、膜锚定序列E′-linker及Tp0751目的基因的原核双表达重组质粒pET28a-E′-Tp0751-E-box,28 ℃诱导重组E.coli BL21表达Tp0751并用Western Blot鉴定;42 ℃诱导形成重组EBG(rEBG),计算裂解效率并用DNA电泳和TEM鉴定。结果构建的EBG裂解率为98.13%,DNA电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成缺乏胞浆成分的细胞空壳并保持活菌基本形态。rEBG在28 ℃时高效表达重组Tp0751蛋白,且仅与梅毒患者血清特异性结合; 42 ℃下其rEBG裂解率为96.37%,电泳和TEM鉴定结果与EBG的相似。结论成功构建表达Tp粘附素Tp0751的rEGB,其所表达目的蛋白具有良好免疫反应性。     

梅毒螺旋体Tp0100蛋白的生物信息学分析及其抗氧化应激作用

目的分析梅毒螺旋体硫氧还蛋白Tp0100的生物学特性及其抗氧化应激作用。 方法利用NCBI、SignalP5.0、TMHMM等生物信息学软件分析Tp0100蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、B细胞表位和与其他菌属的同源性。构建Tp0100原核表达体系,诱导表达重组蛋白Tp0100(rTp0100)。制备相应新西兰兔免疫血清,ELISA法检测特异性IgG抗体滴度。应用流式细胞仪和荧光显微镜检测rTp0100刺激巨噬细胞释放活性氧(ROS)水平。 结果Tp0100蛋白共有185个氨基酸,相对分子质量为20.5 kDa,有信号肽、磷酸化位点,无跨膜域,无糖基化位点。二级结构中氨基酸α螺旋有59个,延伸链44个,β转角21个,无规则卷曲61个;有2个连续的B细胞表位;Tp0100与淋病奈瑟菌硫氧还蛋白具有高度的同源性。成功构建重组质粒pET28a-Tp0100并获得高纯度的rTp0100。该蛋白免疫新西兰兔能够诱导产生高滴度特异性IgG抗体。rTp0100蛋白刺激能降低巨噬细胞内ROS水平。 结论Tp0100蛋白为亲水性蛋白,有B细胞表位;rTp0100具有良好的抗原性,可抑制巨噬细胞内ROS的产生。     

两种检测梅毒螺旋体血清试验的比较

用甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)和梅毒微粒凝集试验(TPPA)同时检测50例梅毒疑似血清，并对两种方法进行比较。TRUST和TPPA试验的敏感性符合率达到84％，但TRUST特异性差。非梅毒螺旋体抗原血清试验可作为梅毒患者的疗效观察(定量试验)；梅毒螺旋体抗原血清试验作为确诊试验很重要。     

梅毒螺旋体膜脂蛋白Tp0821促炎活性研究

目的 探讨梅毒螺旋体(Tp)膜脂蛋白Tp0821潜在的促炎活性及可能参与的信号转导通路。方法表达重组蛋白Tp0821(rTp0821),去除其中内毒素。rTp0821刺激THP-1细胞,ELISA检测促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平;ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特异性抑制剂分别预处理THP-1细胞30 min,再以rTp0821刺激THP-1细胞,ELISA分别检测IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平。结果rTp0821刺激THP-1细胞表达IL-6、IL-8和IL-1β在一定范围内与刺激时间以及蛋白浓度呈正相关,1.0 μg/mL刺激24 h时各细胞因子表达水平最高;rTp0821刺激经ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特异性抑制剂预处理后的THP-1细胞,IL-6表达水平分别下降63.4%(P＜0.001)、4.3%(P＞0.05)、53.4%(P＜0.001)和73.1%(P＜0.0001),IL-8分别下降49.2%(P＜0.001)、6.0%(P＞0.05)、41.1%(P＜0.001)和71.0%(P＜0.001),IL-1β分别下降36.8%(P＜0.01)、3.9%(P＞0.05)、30.3%(P＜0.001)和59.7%(P＜0.001)。结论rTp0821可通过ERK1/2、p38和NF-κB通路诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β,Tp0821可能是Tp重要的致病因子。     

梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136前炎症活性的研究

目的 初步研究梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136潜在的前炎症活性。方法构建重组质粒pET-28a/Tp0136并诱导其表达目的蛋白;将不同浓度(1、2、5、10 μg/mL)的rTp0136分别刺激THP-1源性巨噬细胞,ELISA法分别检测其产生前炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;并同时用二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预先处理巨噬细胞,检测相应细胞因子分泌量。结果成功构建了pET-28a/Tp0136重组质粒,并诱导表达和纯化出rTp0136;重组蛋白能诱导巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α,并且呈浓度和时间依赖性;重组蛋白刺激经PDTC预处理后的巨噬细胞,其IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分别降至32%、35%和27%。结论rTp0136可诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子,该过程可能受NF-κB调控。     

梅毒螺旋体Gpd-IL-2融合基因原核表达重组体的构建、表达及免疫活性的初步研究

目的 以梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白基因Gpd及细胞因子佐剂IL-2为目的基因,融合构建原核表达干组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定并进行免疫活性的初步分析,为进一步开展Tp疫苗动物实验打下基础. 方法 定向克隆构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2进行诱导表达;Ni索和层析纯化重组融合蛋白后,Western blot 检测其免疫反应性;免疫新西兰兔评价重组蛋白的免疫原性. 结果 成功构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定及纯化获得相对分子量约为60 kDa的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性结合,说明两融合基因之间的表达相互没受到太大影响;纯化的Gpd-IL-2重组蛋白免疫新西兰兔能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA检测免疫血清中特异性抗体滴度在1∶6400以上. 结论 Gpd-IL-2融合基因重组蛋白具有良好的免疫活性,这为进一步开展Tp疫苗动物实验条件的优化打下一定的基础.     

梅毒螺旋体金属蛋白酶水解纤维蛋白原的活性研究

目的　研究梅毒螺旋体金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质纤维蛋白原的水解能力,为深入研究TP的致病机制提供实验依据。　方法　采用两点法构建H198A突变型及H202A突变型Tp0751基因,分别构建野生型和突变型Tp0751原核载体进行诱导表达;体外实验检测Tp0751野生型Tp0751蛋白、H198A　Tp0751突变型蛋白、H202ATp0751突变型蛋白对纤维蛋白原的降解活性。　结果　成功表达并纯化了野生型Tp0751蛋白、H198A　Tp0751突变体蛋白、H202A　Tp0751突变体蛋白,各蛋白相对分子量大小约为26kD;纤维蛋白原在与野生型Tp0751蛋白作用约24h后被完全水解;与H198A　Tp0751突变体蛋白作用约24　h后部分水解,尚有部分未被降解;与H202A　Tp0751突变体蛋白作用约24h后几乎不被水解。　结论　野生型Tp0751蛋白具有水解纤维蛋白原的作用;Tp0751蛋白水解纤维蛋白原的活性可能与金属蛋白酶HEXXH域相关,影响Tp0751蛋白对纤维蛋白原的降解的活性位点可能是202位的H而不是198位的H。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

Seroreactivity and immunogenicity of Tp0965, a hypothetical membrane protein of Treponema pallidum

Background  Treponema pallidum (T. pallidum) subsp. pallidum is the causative agent of syphilis. Analysis of recombinant antigens of T. pallidum led to the identification of potential candidate antigens for vaccine development and syphilis serodiagnosis. Tp0965 was predicted to be a membrane fusion protein and was found to be reactive with infected human sera in previous studies, but the results were controversial. In this research, the antigenicity and immunoreactivity of recombinant protein Tp0965 were assessed.

Methods  T. pallidum subsp. pallidum (Nichols strain) was propagated and isolated and the genomic DNA was extracted. The Tp0965 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Then the recombinant protein Tp0965 was expressed in Escherichia coli and purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) purification system. The reactivities of protein Tp0965 were examined by immunoblot analysis and indirect enzyme-linked immunosorbent assay. The antisera against protein Tp0965 were obtained by immune rabbits and the immunogenicity of antisera were detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay.

Results  Recombinant protein Tp0965 was expressed successfully in vitro. Immunoblot assay showed that the recombinant protein Tp0965 could be recognized by human syphilitic sera of all stages. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay showed there were only 4 of 74 human syphilitic sera that failed to show reactivity to recombinant antigen Tp0965, and lack of reactivity of Tp0965 to all 28 uninfected sera. A low titer of antiserum against Tp0965 in immune rabbits could be detected after the third time of immunization.

Conclusions  The recombinant antigen Tp0965 shows excellent sensitivity for the reactivity with sera from syphilitic individuals at all stages. The results also demonstrate a potential application for the serodiagnosis of syphilis.