诱导型一氧化氮合酶在脊髓损伤后组织中的定位和定量研究

 目的研究诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)在大鼠脊髓损伤后局部分布和表达的规律.方法分别于大鼠脊髓压迫伤后6、12、24、48、96h等5个时间点,应用免疫组织化学和图像分析技术,对脊髓组织中iNOS的分布和表达规律进行定位和定量研究.结果iNOS在正常对照组织中没有表达,损伤后开始出现,免疫组化阳性部位为细胞浆内的棕色染色部分,主要分布在脊髓的前角和中央管周围的大多角形细胞以及后角的小圆细胞,图像分析表明伤后12、24、48h等组的测量值分别与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.05).结论脊髓损伤后脊髓组织中存在iNOS表达,其变化规律对进一步研究NO在脊髓损伤中的作用有一定的参考价值.     

银杏叶提取物对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba,Egb)对脊髓损伤后神经细胞的保护作用及其机制.方法 雌性SD大鼠48只,体重200～230 g,用随机数字表法把大鼠分为等渗盐水组(NS组)24只,银杏叶提取物组(Egb组)24只.在T9椎板水平半切脊髓.术后NS组大鼠每天给予2 ml等渗盐水灌胃,EGb761组大鼠每天给予2 ml(20mg)Egb灌胃.分别于术后1,7,14,21 d取材,行髓鞘染色、焦油紫染色、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化和TUNEL法标记凋亡细胞.结果 术后各时相点Egb组大鼠脊髓损伤周围邻近区脱髓鞘明显减轻,坏死囊腔明显减小,损伤侧与正常侧脊髓前角神经元数目比率明显高于NS组(P<0.05),神经细胞凋亡指数和iNOS表达阳性细胞率低于Ns组(P<0.01或P<0.05);而且,iNOS阳性细胞率与细胞凋亡指数间呈正相关(r=0.729,P<0.01).结论 Egb能减少脊髓损伤后神经细胞的凋亡,其机制可能与抑制iNOS表达有关.     

大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶羧基末端PDZ结合配体mRNA的表达

目的 探讨大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶（nNOS）羧基末端PDZ结合配体（carboxy-terminal PDZ ligand of nNOS，CAPON）mRNA的表达变化及其意义。方法采用脊髓横断模型，用实时荧光定量聚合酶链式反应（realtime-PCR）及原位杂交与免疫荧光技术结合的方法检测正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点损伤段脊髓组织中CAPONmRNA的表达，采用cresylviolet染色计数脊髓组织内存活神经元。结果 CAPON mRNA在对照组大鼠脊髓内呈低水平表达于前角神经元，脊髓损伤后表达于灰质各部分神经元及白质。在损伤早期2h表达开始升高，于8h达到高峰，随后1d有下降趋势，3d时稍有上升，损伤后14d恢复至正常水平。而nNOSmRNA在损伤后2h迅速上调，于8h达高峰，随即下降至正常水平。在此过程中，有神经元凋亡现象的发生。损伤后2h存活神经元的数量即减少，随后稍有增多，但仍少于对照组，3d后存活神经元再度减少，持续至14d。结论 大鼠脊髓损伤后CAPONmRNA表达发生变化，提示CAPON可能通过调节nNOS的活性及亚细胞定位而影响神经元的凋亡，在脊髓损伤病理过程中发挥积极的调节作用。     

虎杖苷对急性脊髓损伤大鼠氧化应激反应和炎症反应影响

目的探讨虎杖苷对急性脊髓损伤大鼠氧化应激反应和炎症反应的影响。方法将54只雄性Sprague-dawley大鼠随机分入3组,每组18只:假手术对照组(Sham组),仅行单纯T10椎板摘除;急性脊髓损伤组(SCI组),行单纯T10椎板摘除后,以改良Allen's法制备大鼠急性脊髓损伤模型;虎杖苷治疗组(P组),同SCI组制备大鼠急性脊髓损伤模型后,于术后即刻和术后第1、3、5、7天给予大鼠腹腔注射虎杖苷(20 mg/kg)。比较3组大鼠术后第1、3、7、14天的BBB运动功能评分和斜板实验评分;术后第7天,行苏木素-伊红(HE)染色,观察3组大鼠术后脊髓形态学改变;术后第7天,Western blot法检测3组大鼠脊髓沉默调节蛋白1(SIRT1)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平。结果术后第1、3、7、14天,SCI组的BBB运动功能评分和斜板实验评分均显著低于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);与SCI组比较,P组的BBB运动功能评分和斜板实验评分均显著高于SCI组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,与Sham组比较,SCI组大鼠脊髓中神经元数量和突起锐减,细胞核肿胀且核膜明显,可见明显间质水肿和中性粒细胞浸润;与SCI组比较,P组大鼠脊髓神经元数量和突起明显增多,间质水肿和中性粒细胞浸润明显减轻。与Sham组比较,SCI组大鼠脊髓SIRT1蛋白表达水平显著降低,i NOS、COX-2、IL-6及TNF-α蛋白表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);与SCI组比较,P组大鼠脊髓SIRT1蛋白表达水平显著升高,i NOS、COX-2、IL-6及TNF-α蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论虎杖苷可改善急性脊髓损伤并促进运动功能恢复,其机制可能与抑制脊髓氧化应激反应和炎症反应有关。     

他克莫司抑制脂质过氧化对大鼠脊髓的保护效应观察

目的 探讨大鼠脊髓损伤后早期应用他克莫司对脊髓的保护效应.方法 健康成年雄性Wistar大鼠40只,随机分为他克莫司组(n=20)和损伤组(n=20).采用Allen's法建立大鼠脊髓损伤模型,他克莫司组在脊髓损伤后5min一次性经尾静脉注射他克莫司0.3mg/kg,损伤组以相同方法给予等量生理盐水.伤后3、7、14、21d应用BBB评分法进行后肢运动功能评价,并分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量变化,免疫组织化学染色检测脊髓组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达.结果 与损伤组比较,他克莫司组各时间点行为学评分明显改善(P＜0.05或P＜0.01),血浆MDA含量降低、SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01).损伤组和他克莫司组iNOS蛋白表达均于伤后3d升高,7d达峰值,且他克莫司组各时间点阳性细胞率均明显低于损伤组(P＜0.05或P＜0.01).结论 他克莫司可减少大鼠脊髓损伤后iNOS的表达和自由基生成,从而抑制脂质过氧化损伤,改善神经功能.     

异丙酚对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨异丙酚对大鼠急性压迫性脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法 采用改良Allen’s打击法制备急性脊髓压迫性损伤模型。雄性SD大鼠74只,随机分为正常组（n=4）、脊髓损伤后异丙酚干预组（n=35）和生理盐水对照组（n=35）,采用免疫组化和Western blot法检测脊髓损伤后不同时间点（1h、3h、8h、1d、3d、7d、14d）脊髓组织中iNOS蛋白的表达。结果 与生理盐水对照组比较,异丙酚干预组大鼠损伤后脊髓组织iNOS表达明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05或0．01）。结论 异丙酚可通过抑制iNOS蛋白表达对大鼠急性脊髓损伤起保护作用。     

脊髓损伤后下丘脑部分核团c-fos蛋白表达的实验研究

目的通过观察脊髓损伤后中枢下丘脑室旁核、视上核c-fos样蛋白免疫反应了解中枢与脊髓损伤之间的关系.方法成年大鼠56只,体重(270±20)g,分为脊髓损伤组(20只)、假手术组(20只)、正常对照组(16只).损伤模型为双后肢不全瘫.伤后1,6,12,24h对下丘脑室旁核、视上核组织进行冠状面切片,运用c-fos漂片免疫组化方式对阳性细胞计数.结果脊髓损伤后不同时间组的下丘脑室旁核、视上核均有明显的c-fos阳性表达.伤后1,6,12,24 h室旁核c-fos阳性表达细胞数与假手术组、正常对照组比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01);伤后12,24h视上核c-fos阳性表达细胞与假手术组、正常对照组比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论脊髓损伤影响正常神经信号在大脑中枢传导,下丘脑室旁核、视上核可产生明显反应.     

手术减压时限对脊髓急性不全损伤预后的影响(附67例报告)

目的 探讨伤后不同时间行手术减压对脊髓急性不全损伤患者神经功能恢复的影响.方法 对2000年9月-2008年9月收治的67例颈椎及胸椎骨折脱位合并脊髓不全损伤患者进行回顾性分析,按受伤至手术时间分为3组:A组,伤后1d内(≤24h)行手术治疗(18例);B组,伤后1～3d(24～72h)行手术治疗(35例);C组,伤后3～14d(72～336h)行手术治疗(14例).术后随访1～3年,根据美国脊柱脊髓损伤学会(ASIA)制定的感觉、运动评分标准和Frankel分级记录3组患者术前和术后的神经功能评分与分级情况,并进行统计学分析.结果 术前3组ASIA 评分及Frankel分级差异无统计学意义.术后3组患者感觉、运动评分及Frankd分级与术前比较均明显提高(P<0.01或P<0.05),术后感觉、运动评分A组明显高于B组、C组(P<0.01或P<0.05),B组明显高于C组(P<0.01),Frankel分级A组明显优于B组(P<0.05)和C组(P<0.01),B组和C组间比较无显著差异(P>0.05).结论 手术减压对脊髓不全损伤患者有确定的疗效,且手术越早神经功能恢复越好.     

烯醇化酶抑制剂对大鼠脊髓损伤后自噬及运动功能的影响

目的探讨烯醇化酶(Enolase)抑制剂(ENOblock)对大鼠脊髓损伤后调控自噬相关蛋白表达及促进运动功能的影响。方法选取160只雌性SD大鼠, 按照随机数字表法分为假手术组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂处理组(3-MA组)、脊髓损伤组及ENOblock处理组(ENOblock组), 每组40只。假手术组行背部椎板切除, 但不损伤脊髓。3-MA组、脊髓损伤组和ENOblock组采用改良Allen法打击装置损伤T8脊髓, 建立脊髓损伤模型。3-MA组和ENOblock组分别在伤后立即向鼠尾静脉推注3-MA(2.5 mg/kg)和ENOblock(100 μg/kg)。假手术组和脊髓损伤组向鼠尾静脉推注等剂量的等渗氯化钠溶液。伤后1, 3, 7, 14, 21 d采用BBB评分评估各组双下肢运动功能。伤后3 d采用免疫印迹法检测各组微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ和LC3-Ⅰ比值、自噬效应蛋白(Beclin-1)和多泛素结合蛋白(p62)的表达量。伤后7 d采用免疫荧光法检测各组脊髓组织损伤区域LC3-Ⅱ和Beclin-1的阳性细胞。伤后3 d 采用RT-PCR检测各组脊髓组...     

神经节苷脂对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用

目的 通过观察单唾液酸四己糖神经节苷脂( monosialotetrahexosyl gangliosides,GM-1)对大鼠脊髓损伤后微管相关蛋白-2（microtubule - associated protein 2,MAP -2）和胆碱乙酰转移酶( choline acetyhransterase,ChAT)的表达及运动功能的影响,探讨GM -1对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用及其机制。方法 Wistar雌性大鼠66只（体重260～ 300 g）,随机取6只作为正常对照组,余60只采用改良Allen打击法于Tt0节段制作大鼠急性脊髓损伤模型,并按随机数字表法分为GM -1组（A组）和等渗盐水对照组（B组）,每组30只大鼠。分别于术后1,3,7,14和28 d采用改良Tarlov评分法评价大鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复程度后处死取材,每组各时相点6只大鼠。以免疫荧光染色观察大鼠脊髓损伤后MAP -2和ChAT的表达情况。结果 术后7d起,Tarlov评分在A、B组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),即A组大鼠运动功能恢复优于B组。免疫荧光染色发现,A组术后各时相点MAP -2及ChAT呈阳性表达的细胞数量较B组同时相点明显增多（P＜0.05）。结论 脊髓损伤后大鼠神经功能的恢复与MAP -2及ChAT的表达呈一定的相关性;GM -1可通过增强脊髓损伤后MAP -2及ChAT的表达来保护神经元。     

pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤的修复作用

为观察pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞（SC）移植对脊髓损伤的修复作用，采用切割法制备脊髓半模断损伤模型（T8平面）。实验动物随机植入pSVPoMcat微基因修饰的SC（A组）、SC组（B组）和损伤对照组（C组），每组40只。术后应用联合行为记分（CBS）和皮层体感诱发电位（CSEP）动态观察大鼠功能恢复情况，应用原位杂交和免疫细胞化学方法观察胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。术后3月行MRI观察，并用免疫组化对神经轴突进行神经中丝（NF）染色。结果显示，A组能抑制大学损伤后的GFAP表达；MRI发现，A组大鼠脊髓损伤（SCI）区脊髓信号已基本恢复正常，B组未恢复正常，而C组SCI有软化灶形成。与NF染色发现一致。A、B两组潜伏时波幅呈恢复的趋势，与A组接近正常，与CBS结果一致。提示，pSVPoMcat微基因修饰SC移植能抑制SCI后GFAP的表达，促进神经轴突的生长并对神经功能恢复有明显的促进作用。     

脑源性神经营养因子转基因细胞移植和甲基强的松龙对损伤脊髓caspase-3表达的影响

目的 探讨大鼠脊髓损伤后腺病毒介导的脑源性神经营养因子（AxCA-BDNF）体外转基因成肌细胞移植和静脉内注射大剂量甲基强的松龙（MP）对大鼠脊髓细胞caspase-3表达的影响。方法 将120只大鼠分为脊髓挫伤组（A组）、脊髓挫伤后AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（B组）、脊髓挫伤后静脉内注射大剂量甲基强的松龙治疗组（C组）、AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植和静脉内注射大剂量，甲基强的松龙治疗组（D组）。伤后1，3，7，14，28d，应用免疫组化法对脊髓损伤区进行细胞凋亡caspase-3蛋白表达的测定，并采用计算机图像分析技术进行定量分析。应用行为学和电生理检查方法观察大鼠运动功能恢复情况。结果A、B、C、D四组中均发现凋亡caspase-3蛋白阳性表达细胞；各组caspase-3免疫反应阳性细胞数依次为A〉B〉C〉D组（P〈0．05），与大鼠后肢功能恢复有平行的变化趋势。结论 体外转基因成肌细胞移植和大剂量甲基强的松龙能抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。     

嗅鞘细胞联合甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤区神经中丝表达的影响

目的 观察嗅鞘细胞(olfactory ensheating cells,OECs)移植联合甲基强的松龙(methyprednisolone,MP)对大鼠脊髓损伤区神经中丝(neurofilament,NF)mRNA及蛋白表达的影响,探讨OECs移植联合应用MP促进损伤脊髓修复的机制.方法 以NYU脊髓打击法建立大鼠急...     

大鼠中度脊髓损伤后两种后肢行为学评估标准的比较研究

目的 对大鼠中度脊髓损伤后两种后肢行为学评估标准进行评价.方法 24 只雄性 Wistar 大鼠随机分为假手术组和损伤组.损伤组采用Allen's打击法制作脊髓损伤模型,假手术组仅行椎板切除术.术后1、3、7、14、21天分别采用Tarlov评分和BBB(basso,beattie and bresnahan)评分对两组大鼠后肢运动功能恢复情况进行评估.结果 两组大鼠BBB评分值在伤后各时间点差异均非常显著(P<0.01),Tarlov评分值在伤后各时间点有显著性差异(P<0.05),但只在 1、3、7天时差异才非常显著(P<0.01);评分值按百分制换算后,假手术组大鼠两组评分值之间的一致性较好,仅在伤后7天时有显著性差异(P<0.05),损伤组大鼠两组评分值之间的差异较大,伤后1、3、7天时差异非常显著(P<0.01).结论 BBB评分的敏感性和区分度优于Tarlov评分,能更准确、客观地反映大鼠中度脊髓损伤后运动功能恢复情况.     

丙戊酸对大鼠脊髓损伤后Caspase-3及C-fos表达的影响

目的探讨丙戊酸（VPA）对大鼠脊髓损伤（SCI）后Caspase-3及c-fos表达的影响。方法 60只雄性sD大鼠随机分为3组：假手术组（C组）、损伤组（SCI组）和丙戊酸保护组（VPA组）。采用改良的Allen法制作脊髓损伤动物模型。VPA组术后即刻及其后每12h皮下注射VPA300mg／kg;C组和SCI组在相应时间点注射等体积的生理盐水。伤后6h,每组取5只大鼠处死取材,每组其余大鼠分别在伤后24、48、72h取5只先行后肢运动功能BBB评分,随后处死取材。通过免疫组化法检测Caspase-3及c-fos的表达。结果 BBB评分显示,C组运动功能未受影响,VPA组的BBB评分均高于SCI组,两者相比在伤后48h和72h差异有显著性（P〈0．05）。与C组相比,SCI组和VPA组的Caspase-3表达在各时间点均明显增加（P〈0．05）,而VPA组的增加低于SCI组（P〈0．05）;与C组相比,SCI组和VPA组的c—fos表达在伤后6、24、48h明显增加（P〈0．05）,而VPA组的增加也低于SCI组（P〈0．05）。结论VPA可能通过抑制Caspase-3和e．fos表达,从而对SCI发挥保护作用。     

高压氧对大鼠急性脊髓损伤炎症因子表达的影响

目的 观察大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后早期高压氧(HBO)治疗对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达的影响.方法 将36只SD大鼠随机分为2组:SCI组(18只)和HBO组(18只).2组均采用改良的Allen打击法建造大鼠脊髓损伤模型.模型建造成功后,HBO组于损伤2 h后开始行HBO治疗,1次/d.2组分别于损伤后6、12、24、72、120、168 h各取3只大鼠,取损伤部位脊髓组织采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定其中TNF-α、IL-10 mRNA表达的变化.结果 SCI组大鼠脊髓组织中TNF-α mRNA表达逐渐升高,在伤后12h表达明显上调,至24h达高峰,高表达持续至损伤后72 h;HBO组大鼠脊髓组织中TNF-α mRNA表达变化趋势与SCI组一致,但升高幅度降低(P＜0.05);SCI组大鼠IL-10 mRNA表达在损伤后12 h开始升高,并随时间的推移逐渐升高,至168 h达高峰;HBO组表达变化趋势较一致,IL-10 mRNA升高幅度更明显(P＜0.05).结论 HBO能够减少前炎性细胞因子的释放,增加抗炎性细胞因子的表达,从而减少脊髓组织的继发损伤,保护受损的神经细胞,达到促进恢复的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effects of early HBO therapy on the expressions of pro inflammatory cytokine mRNA including tumor necrosis factor-α (TNF-α ) and interleukin-10 (IL-10) following spinal cord injury (SCI) in rats. Methods Forty SD rats were randomly divided into 3 groups:the sham operation group (n=4) , the SCI group (n = 18) , and the hyperbaric oxygen group (n = 18). Spinal cord injury model was developed by using the modified Allen impact. Then, the SCI group and the HBO group received HBO therapy 2 hours after injury, once a day. And 3 rats were randomly selected at 6, 12, 24, 72, 120 and 168 h following injury to take samples of injured spinal cord tissue and measure dynamic changes in the expressions of TNF-α, IL-10 mRNA by semi-quantitative RT-PCR method. Results Faint expression of the cytokine mRNA could be noticed in the sham group. The expression of TNF-α mRNA in the injured spinal cord tissue in the SCI group elevated gradually, increased obviously at 12 h after injury and reached peak at 24 h, and its high expression maintained till 72 h after injury. The tendency in the expression of TNF-α mRNA in the HBO group was identical to that of the SCI group, however, the amplitude in the increase of TNF-α mRNA decreased (P＜0. 05). The expression of IL-10 mRNA in the SCI group began to increase at 12 h after injury and increased gradually over time and reached peak at 168 h. The expressions of both TNF-α and IL-10 mRNA were more consistent in the HBO group, with more obvious increase in the expressions of IL-10 mRNA. Conclusions HBO could reduce the release of pro-inflammatory cytokines and increase the expression of anti-inflammatory cytokines,resulting in reduction of secondary spinal cord injury,protection of the damaged nerve cells and promotion of recovery.     

聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的效果

 目的 探讨聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。方法 在体外,制备材料和提取干细胞后,将骨髓间充质干细胞种植于聚左旋丙交酯纳米纤维材料上,通过CCK-8法观察材料上干细胞的增殖情况,在维甲酸的诱导分化后,通过光镜和免疫组织化学方法观察材料上干细胞的神经分化。在体内,制备成大鼠脊髓损伤的模型后,分别移植有干细胞黏附的聚左旋丙交酯纳米纤维膜(联合组)、聚左旋丙交酯纳米纤维膜(纤维膜组)、骨髓间充质干细胞(干细胞组),以及空白植入(空白对照组)。术后2、4、8周对大鼠进行BBB功能评分,观察大鼠脊髓损伤修复的效果。结果 体外研究观察发现,在聚左旋丙交酯纳米纤维材料上的干细胞与普通培养皿中的相比,第1、4天未见明显差异,第7天材料上的干细胞增殖好于普通培养皿中的。在纤维材料上的干细胞向神经样细胞的诱导分化也好于普通培养皿中的。体内实验发现,术后4周,联合组、纤维膜组与干细胞组之间未见明显差异,均优于空白对照组,术后8周,联合组优于纤维膜组及干细胞组,且均优于空白对照组。结论 聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤效果良好。