恶性疟原虫FCC1／HN株Pf332基因的克隆和测序

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株红细胞膜相关巨大蛋白（Pf332）部分基因的真核表达载体;并测定Pf332基因序列,了解FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株Pf332基因序列的差异。方法 根据已知Pf332基因序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段;将Pf332部分基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞;阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件辅助分析Pf332序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Pf332重组质粒。测序表明,获得的FCC1/HN株Pf332基因片段大小为1260bp,编码420个氨基酸残基。恶性疟原虫FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株间Pf332基因片段编码的氨基酸残基中分别有1个、15个位点不同。结论 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取Pf332基因片段,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Pf332;FCC1/HN与3D7株间比FCC1/HN与Palo Alto株间的Pf332基因序列的同源性高。     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

恶性疟原虫HRP-Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株HRP-I基因序列,比较FCC1/HN株与国外分离株HRP-I基因序列的差异.方法根据HRP-Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增HRP-I基因.通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP-I.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用分子生物学软件进行不同分离株HRP-Ⅲ基因序列的同源性比较.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HRP-I基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP-Ⅲ重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因全长802bp,包含一个内含子,编码224个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的Itg2、FC27及IMTM22株HRP-Ⅲ基因序列有较高的同源性.结论成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的HRP-Ⅲ基因序列有高度的同源性.     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的　克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。　方法　根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论　成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫海南株Pfs40基因原核表达载体的构建和序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株膜相关钙结合蛋白（Pfs40）基因编码区的原核表达载体,测定Pfs40基因编码区的序列,了解该虫株与其它虫株Pfs40基因序列的差异。方法 根据Pfs40基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs40基因编码区;EcoRV酶切鉴定PCR产物;将Pfs40基因插入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,于卡那阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切,PCR扩增鉴定;用双脱氧链末端终止法进行测序,应用软件对Pfs40核苷酸及推测氨基酸序列进行分析。结果 PCR扩增获得1032bp的Pfs40基因,EcoRV酶切表明扩增产物正确;重组质粒经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子;恶性疟原虫FCC1/HN株与7G89株Pfs40基因核苷酸序列同源性为99.5%,编码氨基酸序列同源性为99.1%。Pfs40理论蛋白质有5个钙结合区EF-hand结构;4个明显的抗原表位区段。结论 从恶性疟原虫基因的DNA中获取Pfs40基因,并成功构建恶性疟原虫FCC1/HN株Pfs40基因编码区的原核表达载体;FCC1/HN株与7G8株Pfs40基因有高度的同源性。     

恶性疟原虫HRP—Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株HRP－Ⅲ基因序列,比较FCC1／HN株与国外分离株HRP－Ⅲ基因序列的差异。方法 根据HRP－Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增HRP－Ⅲ基因。通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP－Ⅲ。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件进行不同分离株HRP－Ⅲ基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP－Ⅲ重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因全长802bp包含一个内含子,编码224个氨基酸,序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的Itg2,FC27及IMTM22株HRP－Ⅲ基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因。序列测定及同源性分离表明,FCC1／HN株与其它分离株的HRP－Ⅲ基因序列有高度的同源性。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)基因序列，比较FCC1／HN株与国外分离株FEN-1基因序列的差异。方法 根据FEN-1基因已知序列设计合成1对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出FEN-1基因，构建重组质粒PMD18-T-FEN-1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN-1基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株FEN-1基因序列，基因全长1947bp，A T含量为56％，G C含量为44％。酶切鉴定获得了正确的PMD18-T-FEN-1重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN-1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株FEN-1基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外已报道各株的FEN-1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1／HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒．测定其序列，比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。方法用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pCDNA3，分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因，大小为1482bp，编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同．与K1株的同源性高达99．8％，但与人的4型HK的同源性只有23．2％～26．6％。结论获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守，但与人的同源性很低．可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的　测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。　方法　采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。　结果　恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。　结论　了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的     

恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析

目的　测定恶性疟原虫海南 (FCC1/HN)株裂殖子顶端膜抗原 1(AMA - 1)基因和Pfs2 30基因序列 ,并分别进行序列分析。方法　根据AMA - 1基因已知序列合成一对引物 ,用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增AMA - 1基因 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3 -AMA - 1。根据Pfs2 30基因已知序列合成七对引物 ,分 7段从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs2 30基因 ,并分别将扩增片段插入pMD - 18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定克隆的AMA -1、Pfs2 30基因序列 ,应用DNAstar软件辅助进行序列分析和同源性比较。结果　PCR扩增得到恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1和Pfs2 30基因片段。恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1基因全长 186 9bp ,无内含子 ,编码 6 2 2个氨基酸残基 ,不存在氨基酸重复序列 ,相对分子量约 72 0 4 5kDa ;Pfs2 30基因全长 94 35bp ,无内含子 ,编码 314 4个氨基酸残基 ,分子量为36 4 36kDa。恶性疟原虫FCC1/HN株与FC2 7、7G8、CAMP、FCR3、Thai -Tn、3D7、FVO、KF1916、CMP1、HB3、K1和V1株AMA - 1的同源性在 94 9%以上 ,各株间有 5 3个位置相同的氨基酸残基替代位点 ,并且发生替代的氨基酸残基具二态性。FCC1/HN株分别比 3D7、7G8株Pfs2 30抗原多 9、10个氨基酸残基 ,三个分离株有 2 8个氨基酸替换     

恶性疟原虫有性期特异抗原Pfs48/45基因的克隆与部分序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南FCC1／HN分离株有性期特异抗原Pfs48／45，为研制恶性疟原虫传播阻断疫苗提供抗原。方法：根据Pfs48／45基因编码区序列设计引物，用PCR扩增DNA，并进行序列分析，双酶切后，定向克隆入pcDNA3载体，转化大肠杆菌TG1，随机取出氨苄青霉素抗性菌落进行PCR扩增，用碱裂解法抽提阳性的重组子DNA，双酶切鉴定。结果：特异扩增了编码Pfs48／45全基因序列（1363bp）；用5端寡核苷酸引物测定了450个碱基，结果表明FCC1／HN分离株Pfs48／455端基因序列与NF54株相应基因基本一致，仅在第307（T→C）和372（T→C）位碱基存在置换；第372位碱基置换产生新的酶切位点TaqI，进一步用TaqI消化PCR扩增产物，产生两个大小分别为984bp和379bp的酶切片段，测序和酶切结果均证实扩增的目的基因确为fs48/45 基因; 将纯化的目的基因片段正向插入pcDNA 3 质粒的BamHI 和EcoRI 位点。结论: 我国海南FCC1/ HN 分离株Pfs48/45 抗原基因序列与NF54 株相应基因高度同源; 成功构建重组质粒pcDNA 3-Pfs48/45     

恶性疟原虫己糖转运体编码基因的体外扩增、克隆及表达

[目的 ]体外扩增、克隆和表达恶性疟原虫海南分离株的己糖转运体 (PfHT1)基因 ,为研究其保护性免疫创造条件。 [方法 ]恶性疟原虫FCC1/HN株的体外培养 ;碱裂解法提取基因组DNA ;PfHT1基因的PCR扩增、克隆 ;脂质体介导法转染HEPG2细胞株及真核表达。 [结果 ]从恶性疟原虫海南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码PfHT1的基因序列 ,片段大小为 15 16bp ;成功构建 pN3 HT1真核表达重组质粒并在肝癌细胞HEPG2中稳定表达。 [结论 ]体外成功扩增、克隆恶性疟原虫PfHT1编码序列 ;重组质粒转染成功并获稳定表达融合蛋白的 pN3 HT1/HEPG2细胞株     

恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因克隆及序列分析

[目的 ]测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)环状体感染红细胞表面抗原 (RESA)基因 3′端部分基因序列 ,比较FCC1/HN与国外分离株RESA序列的差异。 [方法 ]应用PCR技术扩增RESA基因 3′端部分序列 ,将其克隆入pMD18 T载体。阳性重组克隆经酶切及PCR鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定 ,并用分子生物学软件进行基因结构和同源性分析。 [结果 ]用PCR成功扩增出约 846bp的RESA基因特定片段 ,阳性克隆经酶切及PCR扩增确定。基因序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外FC2 7,PaloAlto ,NF7株RESA基因序列有不同程度的差异。 [结论 ]确定了恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因 3′端序列。同源性分析表明 ,FCC1/HN株RESA序列与其他分离株存在一定差异     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因原核表达质粒pET28α-Pf12,测定Pf12基因序列,并为FCC1／HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因,扩增产物经纯化,用BamHI XhoI双酶切,定向克隆入pET28α质粒,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果：筛选出编码FCC1／HN株Pf12基因的原核表达质粒pET28α－Pf12重组质粒的构建,为恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。