Flt3配体修饰小鼠肝癌疫苗的制备及其体内抗肿瘤活性观察

目的:以小鼠Flt3配体(murine flt3 ligand, mFL)的重组腺病毒载体(AdmFL)体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6制备肝癌疫苗,并观察其体内抗肿瘤活性.方法:腺病毒载体体外感染Hepa1-6细胞,48 h后通过载体所携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染的效率;并用ELISA方法检测第0、2、4、6、8天培养上清中mFL的表达量;每天进行细胞计数(连续14 d),观察细胞的体外生长曲线;取5×106个修饰后的Hepa1-6细胞接种C57BL/6小鼠,4周后于原接种部位的对侧再接种2×106个野生型Hepa1-6或EL4细胞.结果:AdmFL能有效感染靶细胞Hepa1-6,培养上清中mFL表达量在第2天最高,达到(71.1±6.3) ng/ml,感染后Hepa1-6的体外生长未受到明显抑制;修饰后Hepa1-6细胞的体内成瘤性下降;4周后再接种Hepa1-6细胞,肿瘤生长速度明显降低;而再接种的EL4细胞呈渐进性生长,与对照组相比无显著差异.结论:腺病毒介导的Flt3配体基因修饰后的肝癌细胞的体内成瘤性下降,并能激发特异性免疫保护反应,是有效的肝癌疫苗.     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

mMIP-1α-DT390重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达研究

目的 构建小鼠MIP-1α(mMIP-1α)基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的真核融合表达载体,并对其功能进行初步研究.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,插入含DT390基因的真核质粒SRα,获得真核表达载体SRα-mMIP-1α-DT390.重组载体经PCR、限制性内切酶酶切及DNA序列测定鉴定,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测目的蛋白的表达,并利用转染NIH3T3细胞后的培养上清体外测定mMIP-1α-DT390融合蛋白的选择性细胞毒活性.结果 成功构建真核表达质粒SRα-mMIP-1α-DT390,mMIP-1α-DT390融合蛋白可在NIH3T3细胞株中正确表达,细胞转染上清对小鼠活化T淋巴细胞具有较强的细胞抑制效应.结论 mMIP-1α-DT390融合基因真核表达载体的获得及功能的部分研究为进一步研究其抗炎效果和临床应用奠定基础.     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建小鼠趋化因子MIP1-α(mMIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达,为肝癌基因治疗提供实验基础.方法:PCR扩增含有mMIP1-α的质粒,将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV- mMIP1-α共转化BJ5183受体菌并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装、扩增和纯化后,感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测mMIP1-α的mRNA.琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中mMIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性.结果:得到了携带mMIP1-α的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011 efu/ml,在感染后的Hepa1-6细胞中检测到mMIP1-α的表达,上清中mMIP1-α的趋化指数为6.3.结论:成功地构建了携带mMIP1-α的重组腺病毒载体,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础.     

腺病毒介导的小鼠Flt3配体抗肝癌基因治疗的研究

目的　观察腺病毒载体介导的小鼠Flt3配体 (mFL)对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法　腺病毒体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1 6 ,4 8h后 ,用绿色荧光蛋白的表达检测感染的效率 ,ELISA检测培养上清中mFL的表达量 ,每天细胞计数 (连续 14d)观察细胞的生长曲线。建立小鼠肝癌模型 ,肿瘤局部分别单次注射 1× 10 9表达形成单位的mFL重组腺病毒、空载体对照和PBS ,观察肿瘤大小和小鼠生存期。治疗 2 0d后 ,取肿瘤消退小鼠的脾细胞过继至正常小鼠 ,3d后接种Hepa1 6细胞 ,观察肿瘤大小 ;治疗 38d后 ,再接种Hepa1 6细胞或EL4细胞对照于肿瘤消退小鼠原接种部位的对侧 ,观察肿瘤大小并作统计学处理。结果　腺病毒体外能有效地感染靶细胞Hepa1 6 ,培养上清中mFL表达量为 80 .5ng·10 -6·2 4h-1± 7.3ng·10 -6·2 4h-1,感染后Hepa1 6的生长未受到明显抑制。瘤体内注射mFL重组腺病毒导致 90 %的小鼠肿瘤消退 ,并显著延长小鼠生存期 ;脾细胞过继能保护正常小鼠免于Hepa1 6细胞的攻击 ;再接种Hepa1 6细胞于肿瘤消退小鼠 ,未见肿瘤生长 ,而再接种的EL4细胞呈渐进性生长 ,与对照组无显著差异。结论　腺病毒介导的小鼠Flt3配体的基因治疗导致肿瘤消退 ,并能激发可过继的、特异性免疫保护反应 ,可能成为有效的肝癌基因治疗的候     

甲胎蛋白基因转录调控元件驱动白细胞介素-2基因在肝癌细胞中的特异性表达

目的利用小鼠甲胎蛋白(AFP)基因转录调控元件驱动白细胞介素-2(IL-2)基因在肝癌细胞中特异性表达.方法构建逆转录病毒载体pDOR-mAFP-IL-2,采用经包装后的病毒分别感染AFP阳性的小鼠肝癌细胞Hepa1-6和AFP阴性的小鼠ψ2细胞,检测IL-2表达.结果该载体能使IL-2基因在Hepa1-6细胞中特异性表达而不能在ψ2细胞中表达.结论采用具有肝癌特异性活性的AFP基因转录调控元件可以驱动IL-2基因在肝癌细胞中特异性表达,为进一步开展直接体内靶向性肝癌基因治疗实验研究提供了依据.     

PSF真核表达载体的构建及细胞内表达和定位

目的构建小鼠多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子（PSF）真核表达载体并在小鼠Hepa1-6肝癌细胞内表达,观察PSF胞内定位及脂多糖（LPS）对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠PSF基因的蛋白编码序列;采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察PSF的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见PSF在Hepa1-6细胞内表达后只分布于细胞核,LPS刺激后PSF分布无明显变化。结论成功构建PSF真核表达载体,为研究PSF在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体;进一步证实PSF为定位于细胞核的核蛋白。     

巨噬细胞炎症蛋白1α修饰的小鼠肺癌疫苗的制备及体内抗肿瘤活性研究

目的以小鼠趋化因子巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)的重组腺病毒载体(AdmMIP-1α)体外感染小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC),观察其体内抗肿瘤活性,探讨其成为肺癌疫苗的可能性。方法AdmMIP-1α体外感染LLC细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染率。连续14 d隔天进行细胞计数,观察细胞的体外生长曲线。取3×106修饰后的LLC细胞接种于C57BL／6小鼠,4周后在MIP-1α瘤苗组未荷瘤小鼠原接种部位的对侧再接种1×106野生型LLC或小鼠淋巴瘤细胞株(EL4)细胞。观察肿瘤体积。结果AdmMIP-1α能有效感染靶细胞LLC细胞,感染后LLC细胞的体外生长无明显改变。修饰后LLC细胞的体内成瘤性下降;4周后再接种LLC细胞,肿瘤生长速度明显减慢;而再接种的EL4细胞呈渐进性生长,与对照组无明显差异。结论表达MIP-1α基因的LLC细胞的体内成瘤性下降,并且能激发特异性免疫保护反应,有可能成为有效的肺癌疫苗。     

SULT2B1影响小鼠Hepa1-6肝癌细胞的HIF-1α，糖酵解及血管新生

 目的 研究羟基类固醇硫酸基转移酶SULT2B1对小鼠Hepa1-6肝癌细胞HIF-1α、糖酵解及血管新生能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 分别用SULT2B1过表达及干扰载体感染Hepa1-6细胞,采用real-time PCR和Western blot检测过表达/干扰SULT2B1对HIF-1α表达水平的影响,同时检测糖酵解相关基因HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平。CCK-8法检测干扰SULT2B1的肿瘤条件培养基(tumor conditioned medium,TCM)对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3增殖能力的影响,并检测VEGF的mRNA表达水平。建立Hepa1-6细胞裸鼠移植瘤模型,免疫组化染色检测裸鼠瘤组织中CD34的表达水平。结果 过表达/干扰 SULT2B1可分别上调/下调HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平,且干扰SULT2B1可使HK Ⅱ和LDH的mRNA表达水平降低,过表达发生相反的变化(P<0.05)。干扰SULT2B1的TCM可抑制bEnd.3细胞的增殖能力,并降低VEGF的mRNA表达水平(P<0.05)。同时,干扰SULT2B1可降低Hepa1-6细胞移植瘤在裸鼠体内的生长并降低瘤组织中的微血管密度(P<0.05)。结论 干扰SULT2B1可抑制Hepa1-6细胞的糖酵解及血管新生能力,其作用主要与下调HIF-1α、HK Ⅱ、LDH及VEGF的表达水平有关。     

DUSP9真核表达载体的构建及其在Hepa1-6肝细胞中的表达

目的构建小鼠DUSP9基因真核表达载体,并在小鼠Hepa1-6肝细胞中表达DUSP9蛋白。方法采用RT-PCR方法,从小鼠肝组织获取DUSP9cDNA片断,经双酶切、连接重组至真核表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-DUSP9重组质粒,双酶切及DNA测序对该重组质粒进行鉴定。脂质体介导pEGFP-DUSP9转染Hepa1-6肝细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测DUSP9mRNA及蛋白表达水平的变化。结果 pEGFP-DUSP9重组质粒经双酶切及测序鉴定证明构建完全正确,成功转染Hepa1-6肝细胞并高效表达,检测到明显上调的DUSP9mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建真核表达载体pEGFP-DUSP9,并在Hepa1-6肝细胞中表达了DUSP9蛋白,可为研究DUSP9的生理功能及了解其在糖、脂代谢、胰岛素抵抗进程中的作用奠定坚实的基础。     

IL-18基因修饰的DC肿瘤融合瘤苗的抗肿瘤效应

目的 :观察腺病毒介导白细胞介素 1 8(Interleukin1 8,IL 1 8)修饰的小鼠树突状细胞 (Dendriticcells,DC)与Hep a1 6肝癌细胞融合后的瘤苗 (IL1 8 DC Hepa)体内诱导的抗肿瘤免疫应答以及对荷瘤小鼠的治疗效果 .方法 :应用T细胞与NK体内删除实验、4h51 Cr释放杀伤实验、酶联免疫吸附实验等方法 ,观察瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用及保护性免疫反应作用机制 .结果 :IL1 8 DC Hepa瘤苗组免疫治疗作用明显优于未转染IL 1 8的融合瘤苗组 (DC Hepa)和LacZ转染对照组 (LacZ DC Hepa) (P <0 .0 5 ) ,阻断CD4 + 、CD8+ T细胞都导致瘤苗免疫治疗作用明显降低 ,阻断NK细胞对抗肿瘤免疫应答具有一定影响 ,表明IL1 8 DC Hepa瘤苗的免疫治疗作用有赖于CD4 + 和CD8+ T细胞及NK细胞 .IL1 8 DC Hepa瘤苗体内诱导特异性CTL杀伤活性明显高于DC Hepa和LacZ DC Hepa组 (P <0 .0 0 1 ) ,诱导脾淋巴细胞产生IL 2和IFN γ的能力显著高于对照组DC Hepa和IL1 8 DC (P <0 .0 0 1 ) ,但各组瘤苗诱导脾淋巴细胞产生IL 4和IL 1 0能力无明显差异 (P >0 .0 5 ) ,表明IL 1 8主要是通过诱导IL 2和IFN γ等Th1型细胞因子来增强DC融合瘤苗的抗肿瘤效应 .结论 :IL1 8 DC Hepa瘤苗进行体内免疫保护和治疗 ,能诱导出显著的抗肿瘤免疫反应 ,为DC介     

外泌体包裹GDF15 siRNA靶向治疗肝癌的研究

目的 在外泌体表面表达肝癌靶向肽SP94,并将生长分化因子15(GDF15)的siRNA包裹至外泌体中，研究其对肝癌的治疗作用。方法 首先设计合成GDF15的siRNA,转染Hepa1-6和H22细胞作为实验组，无靶向的siRNA作为对照组，通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹和流式细胞术验证GDF15 siRNA的功能。再构建一个靶向肝癌的SP94-Lamp2b-HA质粒，转染入HEK293T细胞后提取工程化外泌体SP94-外泌体，用SP94-外泌体包裹GDF15 siRNA作为SP94-siRNA-外泌体实验组，空载SP94-外泌体作为空载对照组，通过尾静脉注射法将两组外泌体导入小鼠体内，研究小鼠原位肝癌模型的治疗效果，并对小鼠的生存期进行观察。另外，将SP94-siRNA-外泌体尾静脉注射入健康小鼠体内，观察器官变化情况，对比血液生物化学和炎性因子指标差异。结果 成功合成GDF15 siRNA,在转染Hepa1-6和H22细胞后，GDF15的mRNA和蛋白水平表达明显降低(P<0.05)。在对原位肝癌小鼠的治疗中，与对照组相比，实验组SP94-siRNA-外泌体明显抑制肿瘤的增...     

转4-1BBL基因小鼠肝癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫应答的研究

目的 :研究转 4 1BBL基因小鼠肝癌细胞疫苗体外诱导淋巴细胞特异性杀伤活性及刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子 (IL 2、TNF α和GM CSF)的能力 .方法 :采用脂质体介导法将真核表达质粒pCDNA3.1(+) m4 1BBL导入小鼠肝癌细胞Hepa1 6 ,经G4 18筛选后获得稳定高表达克隆 ,以丝裂霉素C(MMC)处理后 ,制成肿瘤细胞疫苗 (TCV) ,经体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后 ,测定淋巴细胞特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子 (IL 2、TNF α和GM CSF)的影响 .结果 :转染 4 1BBL的Hepa1 6细胞能够高表达 4 1BBL蛋白 ,并且经MMC处理后制成的瘤苗在培养 4 8h仍能表达m4 1BBL .与野生型的Hepa1 6细胞相比 ,上述瘤苗能诱导淋巴细胞产生针对亲本的小鼠肝癌细胞Hepa1 6的特异性杀伤作用 (P <0 .0 5 ) ,但是对于小鼠肝癌细胞H2 2及成纤维细胞NIH3T3无效 ;此瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子IL 2、TNF α和GM CSF的能力 .结论 :转 4 1BBL基因小鼠肝癌细胞疫苗能诱导有效的抗肝癌免疫反应 .     

人膜连蛋白A2基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

目的:构建重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag,并检测其在小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6的表达情况。方法:利用DNA重组技术将人膜连蛋白A2(annexin A2,ANXA2)基因克隆入慢病毒表达载体pWPT中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag与包装质粒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-ANXA2-Flag,并感染小鼠肝癌细胞株Hepa 1-6,用RT-PCR检测ANXA2 mRNA转录水平,Western blot法检测ANXA2-Flag蛋白的表达情况,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag;RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染Hepa 1-6细胞后,ANXA2基因能够在细胞内正确的转录、翻译并稳定表达ANXA2蛋白;经过LV-ANXA2-Flag感染后,Hepa 1-6细胞S期细胞比例明显高于对照细胞。结论:成功建立ANXA2基因慢病毒表达载体pWPT-ANXA2-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠肝癌...     

mMIP-1α-DT390核酸制剂治疗实验性变态反应性脑脊髓炎的研究

目的 新型重组免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂对实验性变态反应性脑脊髓炎治疗的效果研究.方法 用MBP免疫C57BL/6小鼠诱发EAE,建立人多发性硬化症的动物模型.将构建的真核质粒SRα-mMIP-1α-DT390直接导入EAE模型小鼠C57BL/6肌肉,使重组免疫毒素在其骨骼肌内高效表达.通过对模型小鼠的临床症状的评分、病理切片所显示的中枢神经系统炎症细胞浸润的情况及流式细胞技术检测的外周T细胞的动态变化等指标对核酸制剂的疗效进行评估.结果 新型免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂治疗EAE模型小鼠,使小鼠临床症状得到改善:发病延迟、平均临床评分下降、症状严重程度降低;神经系统的病理切片显示治疗后小鼠的脑部活化的淋巴细胞浸润减轻;流式细胞仪检测结果显示治疗后小鼠外周血T细胞数量下降,而B淋巴细胞基本维持正常水平.结论 所有检测指标均提示该免疫毒素mMIP-1α-DT390核酸制剂可有效的治疗自身免疫性疾病.     

转染MIP-1α和B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤效应的初步研究

【摘要】 目的 观察转染趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤的效应。方法 将MIP-1α和B7-1基因慢病毒重组载体转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞,应用RT-PCR检测MIP-1α和B7-1基因mRNA表达,Western blot法检测MIP-1α和B7-1蛋白表达;转基因EL-4细胞注入小鼠右腋皮下,观察成瘤情况;灭活的转基因EL-4细胞注入成瘤小鼠体内,观察其增强小鼠抗淋巴瘤效应。结果RT-PCR检测发现EL-4/MIP-1α+B7-1细胞内有MIP-1α及B7-1mRNA表达,Western blot显示MIP-1α及B7-1蛋白表达;MIP-1α组、B7-1组较对照组成瘤时间延长,成瘤率降低,肿瘤平均体积较小,而联合组成瘤性消失;MIP-1α和B7-1治疗组的肿瘤平均体积、重量及肿瘤器官转移率明显小于对照组（P＜0.05）,而联合组的肿瘤平均体积及重量明显小于MIP-1α和B7-1组（P＜0.05）,而且联合组小鼠平均生存期,均较单基因组、对照组明显延长（P＜0.05）。结论 转染MIP-1α和B7-1基因能够明显增强小鼠机体抗淋巴瘤效应,明显延长荷瘤小鼠的平均生存期,为淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路。     

康莱特对小鼠肝癌细胞Hepa1-6增殖和凋亡的影响

目的：探讨不同浓度、不同作用时间康莱特（KLT）注射液对小鼠肝癌细胞Hepa1-6增殖和凋亡的影响。方法：采用MTT比色法观察不同浓度KLT对小鼠肝癌细胞Hepa1-6增殖抑制作用。HE染色光镜下观察细胞结构的改变。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：KLT对小鼠肝癌细胞Hepa1-6有明显的抑制效应,呈时间、浓度依赖性（P〈0.01）。光镜下可见细胞形态趋向良性分化。流式细胞仪检测,KLT作用Hepa1-6细胞48 h后,均出现凋亡峰,凋亡率呈浓度依赖性（P〈0.01）。结论：KLT可通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6的生长。     

去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究

目的：探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法：通过Q?PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸（oleic acid,OA）处理后的Hepa1?6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q?PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1?6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q?PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的mRNA及蛋白水平。结果：短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1?6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1?6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP?1c的剪切被抑制。结论：本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP?1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。     

慢病毒载体表达小鼠LAL对肝细胞的作用

目的:为探讨溶酶体酸脂酶(LAL)在代谢性疾病的功能及作用机制,本实验构建小鼠源性LAL基因的慢病毒表达载体,并研究LAL在肝细胞中高表达的作用。方法:根据C57BL/6J小鼠肝脏cDNA文库设计对应引物,定点诱变PCR扩增得到两端含PacⅠ酶切位点的目的基因,经酶切连接至pWPI-GFP慢病毒载体后筛选并测序鉴定。重组载体经Lipofectamine 2000瞬时转染至小鼠Hepa 1-6肝癌细胞系,荧光显微镜观察GFP表达反映转染效率,利用30μg/ml氧化的LDL(ox-LDL)孵育细胞8h作为氧化应激条件,实时定量PCR(qPCR)检测目的基因LAL及肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)等基因的mRNA水平。结果:所构建的pWPI-LAL慢病毒表达载体序列正确,瞬时转染Hepa 1-6细胞有效升高LAL的mRNA表达水平;与基础及氧化刺激下的对照组相比,LAL表达均显著降低炎症相关基因TNFα、IL-6的mRNA水平(P<0.01)。结论:成功构建的pWPI-LAL慢病毒载体可在肝细胞内有效表达,并发挥抗炎作用。