可变数目串联重复序列分析与多位点序列分析在伯氏疏螺旋体分型研究中的应用

目的 评价多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和多位点序列分析(MLSA)两种方法在伯氏疏螺旋体分型研究中的应用.方法 采用MLVA和MLSA两种方法对31株伯氏疏螺旋体分型结果进行比较分析.结果 31株伯氏疏螺旋体用MLVA方法分成4簇,24个基因型,其中21个独立基因型,成簇率达24/31,MLVA的分辨率达到0.969;MLSA可将31株伯氏疏螺旋体分成4簇,每株都可独立分析,但有3个节点步长值(Bootstrap value) ＜50％.结论 MLVA和MLSA两种方法均适合于伯氏疏螺旋体的分型研究,对于部分分型有异议的菌株,将MLVA与MLSA联合可有效进行伯氏疏螺旋体的分型鉴定.     

多位点串联重复序列分析在钩端螺旋体基因分型和流行病学中的应用

由于许多致病性细菌在遗传学上非常相似,使得细菌间的鉴别非常困难.近年来,随着越来越多的细菌全基因组序列分析和测定,DNA串联重复序列逐渐吸引了人们关注的目光.     

福建省结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列基因分型研究

目的 了解福建省结核分枝杆菌的多位点可变数目串联重复序列基因分型(MLVA)的特征.方法 选择15个可变数目串联重复位点(VNTR),检测福建省30个耐药监测点临床分离的结核菌株,结果使用BioNumerics (Version 4.5)软件进行聚类分析.结果 313株结核菌被分为9个基因群(Ⅰ～Ⅸ),分别包含220、9、48、2、1、3、10、10、10株菌,以Ⅰ群为主(70.3％,220/313);Ⅰ群菌株异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和耐多药的耐药率与其他基因群的差异无统计学意义(P＞0.05),但利福平(RFP)耐药率为33.2％(73/220),明显高于其他群菌株RFP的耐药率20.4％(19/93),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 福建省结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以Ⅰ群菌株为主,并与RFP耐药性具有相关性,应加强此类菌株流行的监测.     

62株克罗诺杆菌多位点可变数目串联重复序列分析分子分型研究

目的利用克罗诺杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)分型方法对国内62株克罗诺杆菌进行MLVA分型研究。方法利用文献报道的4个克罗诺杆菌可变串联重复序列(VNTR)位点,应用PCR、毛细管电泳、基因测序方法,使用BioNumerics软件聚类分析菌株MLVA分型多态性。结果 62株菌分为8个群28个MLVA型别,其中II群的菌株数目占总菌株数目的比例最大(43.5%);菌株流行特征呈同一地区具有多个MLVA型别特点,其中MLVA-5型在多个省份有分布。结论国内克罗诺杆菌存在丰富的基因多态性;需要建立和筛选更适合中国菌株的VNTR位点来进一步优化现行的MLVA策略。     

结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分型方法标准化操作程序的建立

目的 建立结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的标准化方法,评价该方法的分型能力、应用价值.方法 选取15个位点,采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对中国54株结核分枝杆菌临床分离株进行分型.结果确定标准化的MLVA方法,包括细菌分离培养、核酸提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳等实验步骤及标化参数的相关数据分析软件的使用.VNTR位点确定为ETRA、ETRB、ETRC、ETRD、ETRE、MIRU10、MIRU16、MIRU23、MIRU26、MIRU27、MIRU39、MIRU40、Mtub21、Mtub30和Mtub39.结论建立MLVA标准化技术方案,该方法操作简便,分型鉴定能力及实验室间结果可比性强,便于网络化,有利于结核病流行中追溯传染源,分析流行趋势.     

中国炭疽芽胞杆菌多位点可变数目串联重复序列分析基因型多态性

目的 分析中国炭疽芽胞杆菌多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）基因型多态性,建立中国炭疽芽胞杆菌MLVA基因型数据库。方法 收集1947年以来中国不同来源的炭疽芽胞杆菌分离菌株,采用MLVA15分型策略进行基因型鉴定,对基因型进行统一编号和命名,分析不同来源菌株MLVA基因型的分布特征,同时通过Bionumerics软件绘制聚类图,分析不同基因型间的遗传关系。结果 MLVA15分型可将533株中国炭疽芽胞杆菌分为4群91个基因型,其中54个基因型为中国独有的基因型。新命名的基因型MLVA15-CHN1~MLVA15-CHN6广泛分布于中国不同地区、不同年代和宿主,其余基因型具有地区和年代特征性。结论 本研究建立了中国炭疽芽胞杆菌MLVA基因型数据库,掌握了MLVA基因型分布特征及其遗传多态性,为中国炭疽疫情防控及分子溯源技术提供了参考依据。     

多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的初步探讨多位点数目可变串联重复序列(MLVA)技术在西藏地区结核分枝杆菌基因分型中的应用和初步了解西藏地区结核分枝杆菌数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法在拉萨、山南、林芝、日喀则、那曲、昌都6个地区结核病防治中心收集结核分枝杆菌临床分离菌株,设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌20个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果共收集到217株结核分枝杆菌,分为19个不同的VNTR基因型,其中以Ⅺ型为主要基因型占87.6%(属于北京家族),其次Ⅵ型、ⅩⅤ型、ⅩⅥ型各占1.38%,Ⅰ型、Ⅶ型、ⅩⅢ型各占0.92%,12株结核分枝杆菌为单一的基因型。不同地区之间,以Ⅺ型为主要基因型,分别占各地区的86.8%、91.3%、78.95%、88.2%、95.05、89.3%。结论西藏地区的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为VNTRⅪ型(即北京家族基因型),初步研究结果显示北京家族基因型与卡介苗接种和耐药性无相关性。MLVA分型方法简单、快速,可以有效地用于结核分枝杆菌的基因分型和病原监测。     

Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的多位点序列分析研究

目的 探讨分析Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的基因型。方法 应用多位点序列分析(multilocus sequence typing,MLST)技术研究仅在我国分离发现的三株Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的基因型,并与MLST数据库收录的当前中国流行血清群进行聚类分析。结果 成功将三株菌株7个管家基因扩增出来,基因测序结果通过与MLST数据库比对,发现这三株菌株MLST结果并不能匹配数据库中已有MLST基因型,表明这三株菌株具有三种不同的MLST基因型。聚类分析结果显示这三株致病性钩端螺旋体形成一个独立的进化分析,与当前在中国流行的七种致病性钩端螺旋体血清群明显不同。结论 发现三种不同致病性钩端螺旋体MLST基因型,这些结果为未来致病性钩端螺旋体分子分型、溯源奠定一定理论基础。     

结核分枝杆菌可变数目串联重复基因分型

目的运用可变数目串联重复（VNTR）分型方法研究农村结核病研究现场的结核分杆菌分离株的分子特征,分析与VNTR优势基因型相关的因素.方法经PCR扩增各分离株的5种确切串联重复位点（ETR-A～ETR-E）.根据扩增产物大小,确定各串联重复单元的拷贝数,得出每个菌株的VNTR基因型.结果研究现场的101株菌株共分为37个不同的VNTR类型,22名病人分离株为单一基因型,79名病人的菌株分属于15个簇,VNTR42435类型占研究菌株总数的38.6%,但该基因型与卡介苗（BCG）接种耐4种一线药的相关性差异均无统计意学义.结论VNTR分型方法简单快速、分型结果数字化,可以把研究菌株分为不同的群.尚不能认为VNTR 42435的优势来自某些抗痨药和BCG接种.     

江西省钩端螺旋体分离株脉冲场凝胶电泳分型和分析

目的 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,对江西省钩端螺旋体(钩体)患者及动物宿主中分离的钩体菌株型别进行分子流行病学调查.方法 利用核酸内切酶Not Ⅰ对提取的钩体菌株染色体DNA进行酶切,通过PFGE将DNA片段分离.获得的PFGE图像采用分析软件BioNumerics 4.0进行处理并建立数字化数据库,以相似度＞75%为标准,将获各钩体PFGE图谱与中国15群15型钩体参考标准株进行比较并进行聚类分析.结果 江西省不同地区(的139株钩体可分为46个PFGE型,优势型为LepNot Ⅰ.0071、LepNotⅠ.0072和LepNotⅠ.0043型,分别占所有钩体菌株的28.06%、15.11%和7.19%.139株钩体分离株中,84.89%(118/139)菌株的PFGE图谱与6群6型中国钩体参考标准株基本相符,其中32.37%(45/139)钩体菌株属于黄疸出血群赖型,15.83%(22/139)和15.11%(21/139)钩体菌株分别属于澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型.结论 PFGE是一种快速、准确、高效的钩体分型方法 .黄疸出血群赖型是江西省人群及动物中优势血清型,澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型位于其次.     

结核分枝杆菌临床分离株MLVA法分型分析

目的 利用多位点数目可变串联重复序列技术,初步探索甘肃省结核分枝杆菌的基因型及其分布,为防治结核病提供科学依据.方法 选择15个VNTR位点,设计引物,采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,并利用BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析.结果 多位点数目可变串联重复序列(MLVA)检测显示,215株结核分枝杆菌呈现7个基因群127种基因型,分别为a、b、c、d、e、f和g基因群,其中e群74.88%(161/215)为主要流行型(spoligotyping鉴定为北京家族基因型);有抗结核治疗史患者菌株成簇率高于无抗结核治疗史患者,差异有统计学意义(χ²=3.91,P=0.046).结论 兰州地区结核分枝杆菌基因DNA指纹图谱呈现多态性,存在主要流行株,MLVA有助于为当地政府部门制定具体的结核病防治政策和公共卫生应急方案提供科学依据.     

云南省鹤庆县2017年分离鼠疫菌分子溯源

目的 了解2017年云南省鹤庆县新分离的鼠疫菌的基因分型,为该地的鼠疫防控提供科学依据。方法 采用差异片段（DFR）、规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPRs）和多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）3种方法对10株鹤庆县新分离鼠疫菌进行分型,并将10株鼠疫菌及邻近疫源地鼠疫菌株93株纳入聚类分析。结果 鹤庆鼠疫菌株与丽江鼠疫疫源地菌株具有相同的DFR型（Genomovar 05型）及CRISPRs型（Ca7簇,22型）,在MLVA聚类分析中,鹤庆鼠疫菌株与丽江野鼠鼠疫菌株位于同一个簇,两者之间仅有2个位点（N2117,M23）的差异。结论 2017年云南省鹤庆鼠疫菌株与丽江野鼠鼠疫疫源地菌株具有很高的同源性,鹤庆县疫情可能是丽江鼠疫进一步向南扩散的结果。     

问号钩端螺旋体mce基因及其编码蛋白特征的初步分析

目的建立基于mce基因的PCR检测方法,分析问号钩端螺旋体（钩体）mce基因保守性,获得钩体mce基因生物信息学分析结果。方法以NCBI/Blast、NCBI/Cds软件搜索Mce内部存在的保守功能结构域及mce基因的特异性;采用TMHMM Server-2.0预测所编码蛋白跨膜区结构;根据已报道问号钩体赖株mce基因设计引物,采用PCR扩增问号钩体赖株全长mce基因,测序并使用DNAStar软件进行测序结果比对。以13株国内流行问号钩体菌株基因组DNA为模板,对基于mce基因PCR检测方法进行验证。扩增产物进行测序、比对,同时根据推定的氨基酸序列做系统发生树。结果生物信息学研究表明,Mce含有与病原菌黏附侵袭相关的Mce超家族保守功能结构域;Mce中存在一明显的跨膜结构;同时,mce基因特异存在于问号钩体中;所克隆的mce基因与已报道序列（GenBank accession No.:NP₇12236）一致;PCR检测结果表明,我国13株问号钩体株均携带mce基因;核苷酸和氨基酸序列相似性均>95%。结论问号钩体mce基因特异、保守存在于各致病性的问号钩体中;Mce具有明显的跨膜结构并含有Mce超家族结构域,与问号钩体黏附侵袭宿主细胞有关。     

钩端螺旋体脉冲场凝胶电泳标准化技术的建立及谱型特征初步分析

目的建立中国钩端螺旋体（钩体）脉冲场凝胶电泳（PFGE）的标准化操作程序及中国15群15型代表菌株的图谱数据库。方法参照目前美国疾病控制中心及亚太地区PulseNet提供的其他病原体PFGE标准化操作程序，结合钩体菌株的特性，对菌体基因组染色体DNA纯化技术、限制性内切酶消解方案及脉冲场电泳参数进行优化。结果利用标准化PFGE操作程序，建立了中国15群15型钩体代表菌株基因组DNA的NotI酶切图谱，并对历年从四川、安徽省钩体病监测工作现场分离的部分黄疸出血群菌株进行PFGE分析，结果发现中国15群15型钩体代表菌株各自具有独特的谱型特征，24株黄疸出血群分离株存在3种谱型特征，91．67％（22／24）的分离株与黄疸出血群赖型（56601）的谱型匹配。结论建立的PFGE标准化操作程序制作钩体菌株的酶切图谱，具有图像清晰、分辨率高、各种大小的片段分布均匀等特点，能较好地反映出中国钩体菌株的分子遗传学特征，与传统的血清学分类存在较好的相关性。     

71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的初步探讨浙江省结核分枝杆菌的数目可变串联重复序列（VNTR）的分型及分布特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株，常规培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）分别对VNTR位点进行检测分析，基因分型聚类分析采用BioNumerics软件。结果对71株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点进行检测。结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析，可分4个基因群（I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），58个基因型。分别为I群占8．5％，含5个基因型，Ⅱ群占18．3％，含13个基因型，Ⅲ群占70．4％，含38个基因型，Ⅳ群占2．8％，含2个基因型。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性，至少存在4个VNTR型，主要流行型为Ⅲ型。     

lipL32—PCR应用于钩端螺旋体检测

目的探讨lipL32-PCR检测方法对钩端螺旋体（钩体）检测的可行性。方法根据外膜脂蛋白基因（@L32）设计引物,与卫生行业标准推荐的引物G1／G2对比,进行特异性与灵敏度研究,并应用于常山县蛙、鼠肾脏标本钩体PCR检测;对浙江省2008年分离菌株进行钩体PCR鉴定。结果lipL32-PCR具有较高的灵敏度和特异性,该引物可特异性扩增致病性钩体DNA,对本实验所用的其他细菌不扩增。2008年分离的钩体菌株PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符;鼠和蛙肾标本进行liL32-PCR和卫生行业标准的G1／G2PCR检测,结果两法符合率为95．0％;lipL32-PCR检测阳性率为10．0％,G1／G2-PCR检测阳性率为5．0％,采用精确计算概率法进行阳性率比较,二者差异无统计学意义（尸：0．25）。结论liL32-PCR检测方法可灵敏、特异地检测致病性钩体,能正确有效地反映野生动物带菌率,为控制钩体病提供依据。     

Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16

Brucellosis is an endemic disease in Central Asia characterized by high infection rates in humans and animals. Currently, little is known about the genetic diversity of Brucella spp. circulating in the region, despite the high prevalence of brucellosis. This study aimed to analyze the genetic diversity of Brucella melitensis and Brucella abortus strains circulating in the Republic of Kazakhstan. We genotyped 128 B. melitensis and 124 B. abortus strains collected in regions with the highest prevalence of brucellosis. Genotyping was performed using multi-locus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA). Analysis of a subset of 8 loci (MLVA-8) of 128 B. melitensis strains identified genotypes 42 (n = 108), 43 (n = 2), and 63 (n = 19) related to the ‘East Mediterranean’ group. An MLVA-16 assay sorted 128 B. melitensis strains into 25 different genotypes. Excluding one variable locus, MLVA-15 of B. melitensis was distinct from strains originating in the Mediterranean region; however, 77% of them were identical to strains isolated in China. A minimum spanning tree for B. melitensis using MLVA-15 analysis clustered the local strains together with strains previously collected in China. MLVA-8 analysis of 124 B. abortus strains identified them as genotype 36, suggesting Eurasian distribution of this lineage. Complete MLVA-16 assay analysis clustered the strains into five genotypes, revealing little diversity of B. abortus when compared on the global scale. A minimum spanning tree for B. abortus obtained using MLVA-15 analysis clustered the 2 most prevalent genotypes (n = 117) together with strains previously collected in China. Thus, MLVA analysis was used to characterize 252 strains of Brucella collected in Kazakhstan. The analysis revealed genetic homogeneity among the strains. Interestingly, identical MLVA-15 profiles were found in seemingly unrelated outbreaks in China, Turkey, and Kazakhstan. Further analysis is needed for better understanding of the epidemiology of brucellosis in Asia.