细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

PVP对人卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

目的 探讨在玻璃化冷冻液中添加大分子物质PVP(polyvinyl pyrrolidone)对人卵母细胞冻融效果的影响.方法 玻璃化液中添加6% PVP者为A组,不添加者B组,未冻融者为对照组(C组),冻融后存活及对照组卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用Nikon CISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态...     

卵母细胞玻璃化冻融获成功妊娠1例

目的 探讨玻璃化冷冻方法在冷冻保存卵母细胞中的临床应用价值.方法 2015年3月在我中心行卵母细胞玻璃化冷冻1例,于2015年7月行玻璃化解冻,行卵胞浆内单精子注射受精,获得胚胎后进行移植和冷冻.结果 共冷冻13枚卵母细胞,解冻后存活12枚(92.3％),对12枚成熟卵母细胞行单精子卵浆内显微注射,9枚(75.0％)正常受精,8枚(88.9％)卵裂,再次解冻移植获单胎妊娠,现正在妊娠中.结论 玻璃化冻融卵母细胞是一种方便可行的方法,在特殊情况下发挥着不可替代的作用,可以获得临床妊娠.     

左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞体外受精结局的影响

目的：研究左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。方法：将卵母细胞分为新鲜组（存活卵数243个）,玻璃化冷冻组（解冻卵数282个）,左卡尼汀高、中、低剂量（2．0、1．0、0．5 g／L）组（解冻卵数分别为285、280和279个）。观察各组卵母细胞中GSH含量、ROS水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果：5组卵母细胞GSH含量、ROS 水平及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均有统计学意义（ F ＝881．290、182．760及χ2＝113．361、21．560、16．660、9．667,P均＜0．05）。与新鲜卵母细胞比较,玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量降低,ROS水平升高,卵母细胞存活率、受精率、卵裂率均降低（ P＜0．05）。左卡尼汀呈剂量依赖性地增加玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量,降低ROS水平（P＜0．05）;高剂量左卡尼汀可明显改善玻璃化冷冻卵母细胞的存活率（ P＜0．05）。结论：左卡尼汀可通过抗氧化作用改善玻璃化冷冻卵母细胞的结局。     

叶酸在玻璃化冷冻中对小鼠卵母细胞的影响

目的探讨叶酸对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响。方法将卵母细胞随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组、叶酸低、中、高剂量(50、100和200mg/L)组。比较各组卵母细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、活性氧(ROS)水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果低、中、高剂量的叶酸均可增加卵母细胞内GSH含量(F=23.814,P<0.01),降低卵母细胞内ROS水平(F=11.209,P<0.01),提高卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率(χ2=124.815、21.117、15.172和9.834,P<0.05)。结论叶酸对玻璃化冷冻卵母细胞具有保护作用,可能与其抗氧化作用相关。     

卵母细胞经冷冻步骤改良的玻璃化法冻融后临床效果分析

目的 探讨卵母细胞经冷冻步骤改良的玻璃化法冻融后行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)受精的临床效果.方法 回顾性对比分析经改良法冻融后的卵母细胞(解冻卵组)与同期基本资料与其匹配的ICSI 患者的新鲜卵母细胞(新鲜卵组)受精后的临床结局.结果 解冻卵组和新鲜卵组的受精率(77.6% vs 76.1%)、卵裂率(98.5% vs 100.0%)、D3优质胚胎率(36.2% vs 27.5%)、优质囊胚(47.7% vs 47.3%)及可利用囊胚比率(52.2% vs 52.6%)差异无统计学意义;解冻卵组有62.5%的患者子宫内膜准备是自然周期,新鲜卵组所有患者均是超促排卵周期;但解冻卵的临床妊娠率及继续妊娠率分别为87.5%和81.3%,均显著性高于新鲜卵组的59.2%和51.3%;流产率新鲜卵组略高(7.1% vs 13.3%),但差异无统计学意义.结论 改良后的冻卵方法极大地改善了卵母细胞的发育潜能,几乎无异于新鲜卵母细胞.     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

解冻液I温度设定的不同对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

『』 目的 探讨预热至37℃的解冻液I和预热至室温(22℃)的解冻液I对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响。 方法 对6周龄昆明系雌鼠进行促排卵,脱去颗粒细胞后选取形态良好的MII期卵母细胞,用含不同浓度DMSO+EG的磷酸盐缓冲液(5%DMSO+5%EG,10%DMSO+10%EG,20%DMSO+20%EG+30%蔗糖)对其进行玻璃化冷冻,储存2天后对小鼠卵子进行解冻复温。将卵子随机分为2组,一组投入预热至37℃的解冻液I(含30%蔗糖的磷酸盐溶液),另一组投入预热至室温(22℃)的相同浓度的解冻液I中,再分别移至预热至室温(22℃)的解冻液II,III和IV(含20%,10%,5%蔗糖的磷酸盐溶液),随后对两组卵母细胞的复苏率进行统计比较。 结果 共计对119枚小鼠卵子进行玻璃化冻融,其中61枚置于预热至37℃的解冻液I,有52枚存活良好,复苏率为82.25%(52/61),其余58枚置于预热至室温(22℃)的解冻液I进行解冻,有23枚存活良好,复苏率为39.66%(23/58),37℃组的复苏率显著高于室温(22℃)组(P<0.01)。 结论 虽然降低平衡时的温度可以减少高浓度玻璃化冷冻保护剂对卵子的毒性作用,但较快的升温速度可以帮助卵子快速通过-120℃～-35℃的危险阶段,而37℃的解冻液I环境较之室温(22℃)能更好的加速这一过程,避免重结晶对细胞的致命损伤。     

两种玻璃化装载工具对人卵母细胞冻融效果的比较

目的 比较自制的Cryotop装载管与商用的Cryotop装载管对人卵母细胞玻璃化冻融效果.方法 冷冻时采用自制的Cryotop装载者为A组,采用商用的Cryotop装载者为B组.比较采用两种装载工具冻融体外受精胚胎移植(IVF-ET)中48 h后受精失败MⅡ(metaphase Ⅱ )卵子(A1、B1组)、获卵日MⅡ卵母细胞(A2 、B2组)及单精子显微注射(ICSI)患者的GV(germinal vesicle)卵子(A3、B3组).结果 冻融受精失败MⅡ卵母细胞部分: A1、B1组的回收率和存活率分别为93.9%、96.8%、82.9%和86.2%,相互比较差异无统计学意义(P>0.05);新鲜MⅡ卵母细胞部分: A2组的回收率、存活率、受精率、卵裂率和优胚率分别为100%、100%、80%、100%和25%; B2组的回收率、存活率、受精率、卵裂率和优胚率分别为100%、100%、60%、100%和33.3%;A2、B2组比较差异无统计学意义;GV期卵子, A3与B3组的回收率、存活率、GVBD率和MⅡ率分别为:100%与90%,81.3%与77.8%,92.3%与85.7%,83.3%与66.7%,与对照组比较差异均无统计学意义.结论 自制Cryotop装载管具有价格低廉的优点且并没有降低冻融效果,可以作为临床运用,特别是科研使用的一种玻璃化冷冻的装载工具.     

Effect of vitrification at the germinal vesicle stage on the global methylation status in mouse oocytes subsequently matured in vitro

Background It is still unclear whether the vitrification procedure itself is associated with the incidence of abnormal DNA methylation during oocytes vitrification.The purpose of this study was to evaluate the epigenetic profile of mouse oocytes,which went through vitrification either at a mature stage or at an immature stage following in vitro maturation （IVM） by analyzing the global DNA methylation.Methods Metaphase Ⅱ （M Ⅱ） stage and germinal vesicle （GV） stage oocytes were collected from adult female mice and were vitrified respectively.The M Ⅱ oocytes were assessed for cryo-survival and global DNA methylation.The GV oocytes were assessed for cryo-survival and only the surviving GV oocytes were cultured in vitro for subsequent assessment of global DNA methylation in mature oocytes.In vivo matured fresh M Ⅱ oocytes without undergoing vitrification were used as control.The level of global DNA methylation in the M Ⅱ oocytes was then examined by immunofluorescence using an anti-5-methylcytosine （anti-5-MeC） monoclonal antibody and fluorescein isothiocyanate （FITC）-conjugated goat anti-mouse IgG under a laser scanning confocal microscope.Results In terms of the effect of vitrification on global DNA methylation status in matured oocytes,in the M Ⅱ-v group,all the examined oocytes （90/90） were found with hypermethylation,including 63.3％ （57/90） of them displaying DNA methylation of a very high level,25.6％ （23/90） with a high level,and 11.1％ （10/90） with an intermediate level,whereas in the GV-v group,all the matured oocytes （129/129） were also examined with hypermethylation,including 67.4％ （87/129） of them displaying DNA methylation of a very high level,23.3％ （30/129） with a high level,and 9.3％ （12/129） with an intermediate level.Statistically,it was similar between both groups,which were similar to the control：68.6％ （83/121） of fresh M Ⅱ oocytes displayed DNA methylation of a very high level,21.5％ （26/121） with a high level,a     

人类卵子改良程序化冷冻和玻璃化冷冻的比较研究

【】目的：研究两种冷冻方法对人类卵子冻融结果的影响。方法：分为程序化冷冻卵子与玻璃化冷冻卵子两组,对于卵子冻融后的复苏率、受精率以及优质胚胎率等指标进行比较。结果：程序化冷冻组卵子的复苏率(71.05%,108/152)显著低于(P<0.05)玻璃化冷冻组(81.75%,103/126),但优质胚胎率(41.07%,23/56)显著高于(P<0.05)玻璃化冷冻组(30.23%,13/53),而受精率、卵裂率及囊胚形成率无统计学差异。结论：玻璃化冷冻卵子可以获得较高的复苏率,但使用改良程序化冷冻试剂盒冻融卵子,可能较玻璃化冷冻获得更好发育潜能。     

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

目的：通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ）,解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs 60.92%vs 69.93%,P〉0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs 96.19%,P〈0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P〈0.01）,且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs 31.34%,P〈0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组,差异均有显著性（28.57%vs 52.38%,P〈0.05;28.57%vs 57.14%,P〈0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs 26.67%,P〈0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好。     

Effect of Mouse Oocyte Vitrification on Mitochondrial Membrane Potential and Distribution简

The effects of mouse oocyte vitrification on mitochondrial membrane potential and distribution were explored in this study. The collected mouse oocytes were randomly divided into vitrification and control groups. Ethylene glycol（EG） and dimethylsulphoxide（DMSO） were used as cryoprotectants in the vitrification group. The mitochondrial function and distribution in the oocytes were examined by using the fluorescent probes, JC-1 and Mito Tracker green. The results showed that the ratio of red to green fluorescence in mouse oocytes was significantly decreased after thawing in the vitrification group as compared with the control group（1.28 vs. 1.70, P0.05）. The percentage of polarized distribution of the mitochondria in oocytes was conspicuously reduced in the vitrification group when compared with the control group（31% vs. 63%, P0.05）. It was suggested that vitrification significantly affects the mitochondrial function and distribution in oocytes and reduces the potential of oocyte fertilization and embryo development.     

Study on the developing potentiality of mouse morula produced in vitro or in vivo after vitrification

Great horovement haS been made in the cryopreservation Of inalnlnalian elnbmp since wnttingham['] reported his Pioneering wold about successful cryOPreservationof mouse embryo. It results in the availability of cryOPreserVation of embryos of all stages[']. HOwever, cryopreserved embryos can not avoid the damages by ice crystal,which is a major cause of cen death in the freezing andthawing ProceduresL',']. SO it is necesseq to seareh for anew and more efficient method for embryO cryOPrese…     

体内、体外产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存后的发育能力

目的　探讨体内、体外产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存后的发育能力。方法体内、体外产生的小鼠桑葚胚分别被含有乙烯甘醇、Ficoll和蔗糖的玻璃化溶液处理后冻存。结果体内产生的小鼠桑葚胚单纯暴露于玻璃化溶液中 ,而未冻存时其发育到胚泡期的百分率为 97 3% (一步法 )和 98 4% (二步法 ) ,与对照组 (98 1% )均无显著差异 (P >0 0 5 ) ,体外产生的小鼠桑葚胚单纯被玻璃化溶液处理后发育到胚泡期的百分率分别为 81 8% (一步法 )、82 4% (二步法 )和 83 6 % (对照组 ) ,三者之间无显著差异 (P >0 0 5 )。但是 ,体外产生的小鼠桑葚胚经玻璃化冻存融解后 ,发育到胚泡期的百分率为 70 6 % (一步法 )、81 3%(二步法 )和 83 6 % (对照组 ) ,一步法玻璃化组明显低于二步法玻璃化组和对照组 (P <0 0 5 ) ,而在体内产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存融解后 ,发育到胚泡期的百分率为 93 1% (一步法 )和 95 7% (二步法 ) ,二者之间无显著差异 (P >0 0 5 )。所有玻璃化冻存的小鼠桑葚胚融解后 ,显微镜下观察均未见透明带破裂。结论体内、体外产生小鼠桑葚胚胎经玻璃化冻存融解后 ,可保持较高的存活率和发育能力 ,二步法玻璃化更适合冻存体外产生的小鼠桑葚胚。