沉默CD133基因对CD133+肝癌干细胞放射敏感性的影响

目的 研究沉默CD133基因对人肝癌CD133+-HepG2干细胞放射敏感性的影响.方法 免疫磁珠分选HepG2细胞;流式细胞术检测分选前后CD133表达率;NOD/SCID小鼠成瘤实验验证其干性;靶向沉默CD133基因并分组(空白组、阴性感染组、阳性感染组);RT-PCR和Western blot检测各组CD133基因mRNA和蛋白表达;克隆形成实验检测各组细胞经不同剂量照射后的克隆形成率及存活率,绘制存活曲线并计算各组细胞放射生物学参数Do、Dq、N及放射增敏比(SER);流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况.结果 流式细胞术检测结果显示,分选前后CD133表达率分别为(1.36±0.20)％和(87.62±1.92)％.CD133+细胞在细胞数为1×103/ml时即可形成皮下移植瘤.RT-PCR和Western blot检测结果显示,阳性感染组CD133 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.流式细胞术检测结果显示:阳性感染组G1、S 期减少G2期增加,细胞凋亡率明显增加.克隆形成实验显示阳性感染组D0、Dq、N值与SF2均减小,放射敏感性明显增强,其SER为(1.37±0.02),差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133作为肝癌干细胞的表面标志物之一,可能成为肝癌干细胞放射治疗增敏的靶点.     

Clusterin基因沉默对脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响

目的：研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默簇集蛋白（clusterin,CLU）基因表达对人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响。方法：设计和合成靶向CLU的短发夹RNA（short hairprin RNA,shRNA）序列（CLU shRNA1,CLU shRNA2）,并构建到慢病毒的载体plentilox 3.7,以不针对任何基因的shRNA序列作为对照（对照 shRNA）。包被能成功表达各种shRNA载体的慢病毒。将慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞,Real-time PCR法和Western blot法测定CLU mRNA表达和蛋白质表达水平,证实干扰效果。给予不同放射剂量（2、4、6 Gy）处理后,通过四甲基偶氮唑盐（thiazolyl blue tetrazolium bxomide,MTT）法及流式细胞仪Annexin V/PI法检测脑胶质瘤U87细胞的存活率及凋亡率。Western blot方法筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果：靶向CLU基因的shRNA特异性地抑制了CLU mRNA和蛋白质的表达。MTT实验结果显示实验干扰组细胞在不同放射剂量下的脑胶质瘤实验U87细胞的存活率与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义（4 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.00３;6 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。流式细胞仪Annexin V/PI法检测结果表明：4 Gy放疗后2个实验组细胞凋亡率均明显增加,最高达（35.54±0.95）%,较对照组高2倍多,差异具有明显统计学意义（对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000;对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。Western blot 法发现CLU沉默可以显著上调促凋亡分子Bax蛋白水平。结论：CLU基因沉默可能通过调控Bax蛋白的表达,明显增强脑胶质瘤U87细胞对放射的敏感性,有望成为增加脑胶质瘤放射敏感性的新靶点。     

MRP-1、MDR1、GST-π mRNA在CD133~+肿瘤干细胞中的表达分析

目的分离鉴定CD133~+肿瘤干细胞,初步分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞多药耐药性中的作用。方法采用胶质瘤U+251细胞系、磁珠分离,培养CD133~+胶质瘤干细胞,RT-PCR技术分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中的表达。结果培养的胶质母细胞瘤干细胞表达干细胞标记物Nestin,分化后细胞表达GFAP、β-tubulin;MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中呈高表达,与CD133-胶质瘤干细胞比较差异有统计学意义(P0.05)。结论培养、鉴定胶质母细胞瘤肿瘤干细胞、MRP-1、M DR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中呈高表达,为下一步研究奠定基础。     

共济失调-毛细血管扩张症致病基因RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的:观察共济失调-毛细血管扩张症致病基因(ATM基因)的RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响.方法:选择ATM基因不同区域的DNA序列合成并纯化寡核苷酸后转染人胚胎肾脏细胞HEK293,根据对ATM蛋白不同的阻断效应,筛选用于制备ATM发夹结构short hairpin structure(shRNA)基因的最佳序列.将有效序列克隆入pSilencer 1.0-U6载体中,构建出shRNA的表达质粒并转染恶性胶质瘤细胞系U87细胞.以U87细胞为对照,应用Western blot检测细胞中ATM基因的表达;以细胞存活分数(SF)来评估放射敏感性.结果:Western blot显示shRNA介导的ATM基因沉默能明显阻断U87细胞中的ATM蛋白;与U87细胞相比,U87 shRNA细胞SF明显降低,P＜0.05.结论:由ATM shRNA构建的表达质粒能明显抑制ATM表达,增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

U251细胞系中脑肿瘤干细胞耐药性的初步研究

目的 探讨脑肿瘤干细胞对抗肿瘤药物的耐药性及其机制.方法 通过磁珠分选(MACS)将U251细胞中的CD133+与CD133-细胞进行分选,用MTT法和流式细胞技术比较CD133+与CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷(Vm-26)、卡莫司汀(BCNU)和顺铂(DDP)的敏感性、细胞凋亡率及细胞内药物蓄积的差异性,通过RT-PCR检测CD133+与CD133-细胞耐药基因谱的差异.结果 U251细胞系中,CD133+细胞约占5.4%.分选后的CD133+细胞的阳性率可达92.4%,CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷、卡莫司汀和顺铂的敏感性明显高于CD133+细胞;流式细胞仪试验显示,在中等浓度的替尼泊苷作用下,CD133-细胞的凋亡明显,并出现明显的"亚G1峰",而CD133+细胞并未受到明显抑制和杀灭;流式细胞仪检测显示CD133+细胞内的药物蓄积明显低于CD133-细胞;RT-PCR实验显示MDR1、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表达在CD133+明显高于CD133-细胞.结论 CD133+是U251细胞系中的耐药细胞亚群,高表达ABC转运体,DNA修复和抗凋亡基因可能是CD133+细胞耐药的重要机制.     

构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的 构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法 过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVXshRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低（P均<0.05）。结论 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。     

沉默lncRNA HCP5上调miR-508-3p表达增加胶质瘤细胞的辐射敏感性

目的探讨长链非编码(lnc)RNA HCP5对胶质瘤细胞的辐射敏感性的影响及其机制。方法分别用0、2、4、6、8 Gy射线照射胶质瘤细胞U251和U87,作为不同剂量辐射组;将si-con、si-HCP5、pcDNA、pcDNA-HCP5转染至细胞U251和U87中,分别记为si-con组、si-HCP5组、pcDNA组、pcDNA-HCP5组;将si-con、si-HCP5转染至细胞U251和U87后再用4 Gy射线照射,分别记为IR+si-con组、IR+si-HCP5组,仅用4 Gy射线照射的细胞记为IR组;将si-HCP5分别与anti-miR-con、anti-miR-508-3p共转染至细胞U251和U87后再用4 Gy射线照射,分别记为IR+si-HCP5+anti-miR-con组、IR+si-HCP5+anti-miR-508-3p组,转染均用脂质体法。采用RT-qPCR检测miR-508-3p和HCP5的表达;细胞克隆形成实验检测胶质瘤细胞的放射敏感性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测磷酸化H2AX(γ-H2AX)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果放射处理的胶质瘤细胞HCP5高表达,miR-508-3p低表达;沉默HCP5后细胞U251和U87放射敏感性增强,细胞凋亡率升高[U251:(16.67±1.68)%,(3.58±0.62)%,t=21.929,P<0.05;U251:(12.32±1.08)%,(4.48±0.71)%,t=18.198,P<0.05],γ-H2AX[U251:(0.45±0.04),(0.23±0.05),t=10.307,P<0.05;U87:(0.38±0.04),(0.24±0.03),t=8.400,P<0.05]、Cleaved caspase-3[U251:(0.37±0.04),(0.16±0.03),t=12.600,P<0.05;U87:(0.38±0.04),(0.22±0.03),t=9.600,P<0.05]表达水平升高。相比单独沉默HCP5或辐射处理,沉默HCP5同时辐射处理U251细胞,细胞凋亡率[(25.34±1.54)%,(16.67±1.68)%,t=11.413,P<0.05;(25.34±1.54),(11.13±1.06),t=22.802,P<0.05]显著升高,γ-H2AX[(0.69±0.05),(0.45±0.04),t=11.245,P<0.05;(0.69±0.05),(0.31±0.04),t=17.804,P<0.05]、Cleaved caspase-3[(0.52±0.06),(0.37±0.04),t=6.240,P<0.05;(0.52±0.06),(0.34±0.04),t=7.488,P<0.05]表达水平升高。辐射处理后且沉默HCP5后U251和U87细胞中p-PI3K[(0.21±0.02),(0.52±0.04),t=20.795,P<0.05;(0.26±0.23),(0.67±0.07),t=5.116,P<0.05]、p-AKT[(0.22±0.03),(0.66±0.07),t=17.332,P<0.05;(0.23±0.04),(0.71±0.03),t=28.800,P<0.05]表达水平降低。HCP5可靶向调节miR-508-3p表达;干扰miR-508-3p逆转了沉默HCP5和辐射对U251和U87细胞放射的增敏和促进细胞凋亡的作用,降低了γ-H2AX、Cleaved caspase-3表达水平,提高了p-PI3K、p-AKT表达水平。结论沉默lncRNA HCP5可增强胶质瘤细胞的辐射敏感性,促进细胞凋亡,其机制可能与miR-508-3p及PI3K/Akt信号通路有关,可为胶质瘤治疗提供新靶点和新思路。     

胶质瘤干细胞分离鉴定及其化疗敏感性研究

目的:探讨胶质瘤干细胞的分离、培养、鉴定及其与胶质瘤细胞化疗敏感性方面的差异.方法:将3株人胶质瘤细胞SHG-44、U251、U87MG分别接种于无血清培养基,从中分离出各自胶质瘤干细胞;扫描电镜观察胶质瘤干细胞的形态;RT-PCR法检测胶质瘤干细胞CD133、GFAP的表达;CCK8法检测化疗药物顺铂及长春新碱分别作用后胶质瘤细胞及其干细胞活性的变化.结果:从3株胶质瘤细胞中分离出的胶质瘤干细胞,可在体外增殖及传代,表达特异性标志物CD133,不表达GFAP.CCK8法检测出胶质瘤干细胞较胶质瘤细胞更为耐药(均P＜0.05).结论:胶质瘤干细胞较胶质瘤细胞化疗敏感性降低.     

骨肉瘤干细胞来源外泌体对T细胞增殖及分化的影响

目的探讨骨肉瘤干细胞(osteosarcoma stem cells,OSCs)来源的外泌体对T细胞增殖及分化的影响及其相关作用机制。方法采用无血清悬浮培养获得OSCs,并利用干细胞标志物流式分选技术进行鉴定。试剂盒提取骨肉瘤干细胞分泌的外泌体(OSCs-exo),利用透射电镜、粒径分析及Western blot实验进行鉴定。将OSCs-exo与PBMC进行共培养,CFSE染色及细胞流式实验检测其对T细胞增殖的影响。Western blot实验检测ERK信号通路中ERK蛋白的磷酸化改变。免疫磁珠分选CD4~+T细胞,并将其与OSCs-exo在不同CD4~+T细胞亚群诱导分化液中进行共培养细胞流式实验检测OSCs-exo对后者分化的影响。Western blot实验检测STAT信号通路中磷酸化STAT1、STAT3、STAT5蛋白的表达。结果成功分离获得了OSCs CD133~+MG-63,透视电镜、粒径分析及Western blot实验结果表明OSCs-exo为直径在30-100 nm的圆形或椭圆形囊泡结构,其高表达外泌体标志性蛋白CD63、HSP70。CFSE染色及细胞流式实验及Western blot实验结果显示OSCs-exo可能通过抑制ERK蛋白磷酸化抑制CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞的增殖通过抑制磷酸化STAT1、STAT3蛋白的表达抑制CD4~+T细胞向Th1、Th17并促进其向Th2、Treg细胞的分化。结论骨肉瘤干细胞来源的外泌体能够通过下调ERK蛋白的磷酸化抑制T细胞的增殖,并降低磷酸化STAT1与STAT3蛋白的表达以诱导CD4~+T细胞向Th2、Treg细胞分化,而抑制其向Th1、Th17的分化,从而下调细胞免疫功能,促进肿瘤的进展。     

RNA干扰抑制CD133 表达对CD133+肝癌干细胞增殖和化疗敏感性的影响

目的利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调CD133+
HepG2肝癌干细胞中CD133的表达,探讨其对肝癌干细胞增殖及化疗敏感性的影响。方法利用流式分选技术筛选CD133+
HepG2细胞并检测分选前后CD133表达量,体外成球及体内成瘤实验
鉴定其“干性”;随后以CD133mRNA编码序列为干扰靶点,采用慢病毒介导的shRNA转染CD133+细胞。应用RT-PCR和
Western Blot检测CD133mRNA及蛋白表达,克隆形成实验检测转染前后细胞增殖情况,CCK-8法和流式细胞仪检测在化疗药
物顺铂作用下转染前后细胞的生长抑制率及凋亡情况。结果分选前后CD133表达率分别为（3.36±1.80）%,（ 88.74±3.19）%;
CD133+细胞相对于CD133-细胞有更强的体外成球和体内成瘤能力;转染CD133shRNA后的细胞CD133mRNA表达明显受到
抑制（P<0.05）,蛋白表达水平降低,增殖能力显著下降（P<0.01）。顺铂对转染CD133shRNA后细胞生长抑制作用明显提高（P<
0.01）,且其在顺铂作用下的凋亡率也显著增加（P<0.05）。结论慢病毒介导的shRNA能显著下调CD133+肝癌干细胞CD133基
因的表达,抑制其增殖并提高其对顺铂的敏感性。
     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …