AMPK信号通路调控的自噬在七氟烷后处理保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的机制研究

研究七氟烷后处理对在体大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用,探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的自噬流在七氟烷后处理心肌保护中的作用。成年雄性SD大鼠50只,建立急性大鼠在体心肌I/R损伤模型。随机分为5组:假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟烷后处理组(SP组)、Compound c溶剂二甲基亚砜组(DMSO组)、AMPK抑制剂Compound c组(Com c组)。除Sham组,其余各组缺血30 min,再灌注4 h末。再灌注4 h末,提取心脏,采用氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)测定心肌梗死范围。采用免疫印迹法(Western blot技术)检测p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62蛋白表达水平。与I/R组比较,SP组心肌梗死范围减小,p-AMPK/t-AMPK蛋白表达上调而LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达下调(P0.05);与SP组比较,Com c组心肌梗死范围增加,p-AMPK/t-AMPK蛋白表达下调而LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调(P0.05)。DMSO组相比于SP组差别无统计学意义(P0.05)。七氟烷后处理减轻了在体大鼠心肌I/R损伤,其机制可能是通过激活AMPK信号通路,减少再灌注期间自噬体的蓄积,保护自噬流进而发挥保护作用。     

PPARγ激动剂罗格列酮对心肌缺再灌注损伤的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制. 方法: 42只SD大鼠随机分为假手术组(14只)、I/R组(14只)和I/R+Ros组(14只).应用结扎左冠状动脉60min,再灌注60min的方法制作心肌缺血再灌注模型;用NBT染色法判断心肌梗死面积;用放射免疫法测定血浆及心肌血管紧张素Ⅱ和醛固酮等指标. 结果: 与I/R组相比,I/R+Ros组降低心肌缺血再灌注后心肌梗死面积23.9%(P<0.05);显著减轻心肌肿胀度(P<0.05);明显抑制心肌血管紧张素Ⅱ、醛固酮及血浆血管紧张素Ⅱ水平(P<0.05). 结论: PPARγ激动剂罗格列酮对心肌缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抑制心肌局部肾素-血管紧张素系统有关.     

心肌缺血后处理对大鼠I/R心肌梗死范围及蛋白激酶Cα的影响

目的:探讨心肌缺血后处理(IPTC)对心肌缺血/再灌注(I/R)梗塞面积和PKCα表达的影响。方法:Evan’s蓝、TTC染色,观察心肌IPTC与缺血预处理(IPC)对大鼠I/R心肌梗死范围(IS)的影响,免疫组化技术观察心肌IPTC对心肌组织中PKCα的表达。结果:①IPTC组的梗死面积(IS)显著低于I/R组(P <0 . 0 1) ,心肌细胞膜PKCα表达明显多于I/R组(P <0 . 0 1) ;②IPTC组的IS、心肌细胞膜PKCα的表达与IPC组无显著差异(P >0 . 0 5 )。结论:心肌IPTC能减少大鼠心肌梗死范围,其机制可能与心肌细胞膜PKCα的表达有关。     

延迟预适应对兔心脏缺血再灌注损伤保护作用的研究

目的:观察延迟缺血预适应(IschemicPreconditioning,IPC)对兔在体心脏缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤的保护作用。方法:方法18只兔随机分为3组:假手术组(CON组,n=6),缺血再灌注组(I/R组,n=6),预适应组(IPC组,n=6)。采用免疫组化方法检测诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)及内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)在心肌及冠状动脉内皮中的表达情况。结果:IPC组的梗死面积明显小于I/R组。在心肌中,IPC组iNOS表达明显高于I/R组与CON组,而eNOS无显著性差异。在内皮中,IPC组eNOS表达明显高于I/R组,与CON组无显著性差异,而iNOS均无表达。结论:延迟缺血预适应能缩小兔缺血再灌注后心肌梗死面积。     

大鼠在体心脏缺血后处理模型的建立与优化

目的建立并优化大鼠在体心脏缺血后处理(I-postC)模型。方法采用冠状动脉左前降支垫扎球囊法建立在体心脏I-postC模型,健康雄性SD大鼠随机分为7组(n=8):缺血/再灌注(I/R)组(冠状动脉左前降支缺血45min/再灌注2h)、缺血预处理(IPC)组(I/R前先行3轮缺血5min/再灌注5min处理)、I-postC组(包括4个亚组,于冠脉缺血45min后先进行3或4轮再灌注30s/缺血30s或再灌注60s/缺血60s后处理后再进行冠脉再灌注)以及假手术(sham)组。氯化三苯四氮唑(TTC)法测定心肌梗死面积,试剂盒检测血浆乳酸脱氢酶(LDH)和心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果I/R引起明显的心肌梗死和组织损伤,采用冠状动脉左前降支垫扎球囊法进行I-postC可以显著减少I/R后心肌梗死面积,尤以3或4轮再灌注30s/缺血30s组保护作用明显,其梗死区占缺血区百分比分别比I/R组下降30.26%和58.81%(P分别<0.05),与IPC保护效果相近。结论I-postC可以减轻心肌I/R损伤,其中4轮再灌注30s/缺血30s诱导的I-postC在限制心肌梗死面积方面作用最明显,是理想的大鼠在体心脏I-postC模型。     

天麻素预处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨天麻素对大鼠离体心脏缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、缺血/再灌注组、天麻素预处理(10、50、100、200μmol/L)组,应用Langendorff离体心脏灌注系统建立心脏I/R损伤模型。除正常对照组外,各组分别进行平衡灌注、全心停灌/再灌处理,从心功能各项指标、心肌酶学、心肌梗死面积(TTC染色)及组织病理学(HE染色)变化4个层面评估天麻素预处理对大鼠离体心脏(I/R)损伤的影响,评价不同浓度天麻素预处理对心脏(I/R)损伤心肌的保护作用。结果与缺血/再灌注组相比,不同浓度天麻素预处理组均可改善缺血/再灌注损伤心功能的各项指标,包括左心室发展压(LVDP)、左室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)和心率(HR);并降低冠脉流出液中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白(Trop-I)的活性,有效减少心肌梗死面积,其中以100μmol/L浓度的天麻素效果最显著(P0.05)。结论天麻素预处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注引起的心肌损伤有保护作用,其中以100μmol/L的保护作用最为显著。     

二氧化硫对大鼠缺血再灌注心脏的损伤作用

目的观察二氧化硫(SO2)在心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法大鼠心脏分为:I/R组,SO2组及天冬氨酸异羟肟酸(HDX)组。采用Langendorff离体心脏灌注模型。MacLab数据采集系统监测离体心脏功能。结果SO2组心功能恢复率明显低于I/R组(P<0.05,P<0.01);HDX组显著高于I/R组(P<0.05,P<0.01)。SO2组冠脉流液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷氨酸-草酰乙酸转移酶(GOT)活性、肌红蛋白(Mb)含量及心肌丙二醛(MDA)、共轭双烯键(CD)含量及GOT活性显著高于I/R组(P<0.05,P<0.01);HDX组冠脉流液中上述指标明显低于I/R组(P<0.05,P<0.01)。SO2组心肌还原型谷胱甘肽(GSH)含量明显低于I/R组(P<0.05);HDX组心肌GSH含量显著高于I/R组(P<0.01)。结论SO2参与了大鼠心肌缺血再灌注损伤。增加心肌脂质过氧化及降低心肌还原型谷胱甘肽含量可能与SO2心肌损伤有关。     

17β-雌二醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的 观察17β-雌二醇对大鼠心缺血再灌(I/R)损伤的保护作用并探讨其机制. 方法 30只成年雌性SD大鼠卵巢切除后,随机分成C组(I/R假手术组)、 I/R组和 I/R+E2组(17β-雌二醇预处理).17β-雌二醇预处理2周后建立大鼠心肌缺血再灌注模型,用氯化三苯甲基四氮唑(TTC)染色法测量心肌梗死范围,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,免疫组织化学方法检测心肌细胞原癌基因c-fos的蛋白表达. 结果 17β-雌二醇能明显减少缺血再灌注心肌梗死体积,降低心肌细胞凋亡率,减弱缺血再灌注心肌细胞c-Fos的表达. 结论 雌激素对大鼠缺血再灌注心有保护作用,其作用机制可能与抑制原癌基因c-fos的蛋白表达有关.     

钙预处理对离体大鼠缺血再灌注心肌细胞的保护作用

目的 :研究钙预处理是否对缺血再灌注心肌有保护作用 ,其作用是否通过蛋白激酶C(ProteinKinaseC ,PKC)及线粒体ATP依赖性钾通道 (KATP)起作用。方法 :3 2只SD大鼠 ,随机分为 4组 :缺血再灌注组 (I/R组 )、钙预处理组 (CPC组 )、钙预处理加PKC阻滞剂Chelerythine组 (CLT组 )、钙预处理加线粒体KATP通道阻滞剂 5 hy droxydecanoate组 (5 HD组 ) ,分别检测LDH及CK的漏出量、心肌ATP含量、心功能指标 (LVSP及±dp/dtmax)。 结果 :与I/R组比较 ,CPC组CK、LDH漏出量明显减少 (P <0 .0 1) ,心肌ATP含量增加 (P <0 .0 1) ,心功能改善 ;CLT组及 5 HD组上述各指标 (LDH、CK、ATP、LVSP及±dp/dtmax)分别与I/R组相同指标之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :钙预处理对I/R心肌有保护作用 ,其保护作用可被PKC阻滞剂及KATP阻滞剂所取消 ,提示其保护作用可能通过PKC途径及线粒体KATP通道起作用     

丝裂原活化蛋白激酶p38的激活在四逆汤预处理诱导大鼠心肌延迟预适应中的作用

目的：探讨四逆汤能否诱导心肌延迟预适应及其机制。 方法： SD大鼠分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注(I/R）组、延迟缺血预处理组、四逆汤预处理组。延迟缺血预处理组采用经典大鼠冠脉结扎，缺血5 min，再灌5 min，反复循环3次，24 h后缺血1 h，再灌1 h。四逆汤预处理组给予四逆汤灌胃(5 mL·kg-1·d-1)连续3 d，末次灌药24 h后缺血1 h，再灌1 h。以心肌梗死面积、心肌酶为评价指标，测定心肌中NO2-/NO3-的含量并通过免疫组化检测大鼠心肌p38 MAPK及PKC的表达。 结果： 延迟缺血预处理组及四逆汤预处理组心肌梗死面积、血清CK、LDH的值明显少于I/R组，NO2-/NO3-含量显著高于I/R组，p38 MAPK和PKC发生转位且蛋白表达明显高于I/R组。 结论： 四逆汤能诱导心肌延迟预适应，其机制与p38 MAPK的激活可能有关。     

升压治疗急性脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

目的:探讨升压治疗局灶性脑缺血的保护作用及治疗的维持时间。方法:采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,40只大鼠随机分为五组:模型对照组(A)、升压维持15min组(B)、维持45min组(C)、维持90min组(D)和120min组(E),观察各组神经功能评分、脑梗死体积和病理学改变。结果:神经功能缺损评分B、C、D组明显低于A组;B、C、D、E各组脑梗死体积明显低于A组,C、D、E组明显低于B组;各治疗组组织病理学改变比对照组轻,B组最轻。结论:缺血3h再灌注时,升压维持时间在2h以内对脑损伤有保护作用,升压最佳维持时间是15min。     

Post‐ischaemic activation of kinases in the pre‐conditioning‐like cardioprotective effect of the platelet‐activating factor

Aim: Platelet‐activating factor (PAF) triggers cardiac pre‐conditioning against ischemia/reperfusion injury. The actual protection of ischaemic pre‐conditioning occurs in the reperfusion phase. Therefore, we studied in this phase the kinases involved in PAF‐induced pre‐conditioning. Methods: Langendorff‐perfused rat hearts underwent 30 min of ischaemia and 2 h of reperfusion (group 1, control). Before ischaemia, group 2 hearts were perfused for 19 min with PAF (2 × 10^?11 m ); groups 3–5 hearts were co‐infused during the initial 20 min of reperfusion, with the protein kinase C (PKC) inhibitor chelerythrine (5 × 10^?6 m ) or the phosphoinositide 3‐kinase (PI3K) inhibitor LY294002 (5 × 10^?5 m ) and atractyloside (2 × 10^?5 m ), a mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opener respectively. Phosphorylation of PKCε, PKB/Aκt, GSK‐3β and ERK1/2 at the beginning of reperfusion was also checked. Left ventricular pressure and infarct size were determined. Results: PAF pre‐treatment reduced infarct size (33 ± 4% vs. 64 ± 5% of the area at risk of control hearts) and improved pressure recovery. PAF pre‐treatment enhanced the phosphorylation/activation of PKCε, PKB/Aκt and the phosphorylation/inactivation of GSK‐3β at reperfusion. Effects on ERK1/2 phosphorylation were not consistent. Infarct‐sparing effect and post‐ischaemic functional improvement induced by PAF pre‐treatment were abolished by post‐ischaemic infusion of either chelerythrine, LY294002 or atractyloside. Conclusions: The cardioprotective effect exerted by PAF pre‐treatment involves activation of PKC and PI3K in post‐ischaemic phases and might be mediated by the prevention of mPTP opening in reperfusion via GSK‐3β inactivation.     

Effects of late reperfusion on infarct expansion and infarct healing in conscious rats.

We examined the effects of late reperfusion on infarct expansion and infarct healing process in conscious rats. Coronary occlusion and reperfusion were carried out in conscious rats 1 week after appropriate surgical preparations. The rats were randomized into the following four groups: sham operated, permanent occlusion, early reperfusion (i.e., reperfusion performed 1 hour after occlusion), and late reperfusion (i.e., reperfusion performed 6 hours after occlusion). Histological examination was performed 7 days after coronary occlusion. In the early reperfusion group, infarct size and expansion were reduced when compared to the permanent occlusion group. In rats subjected to late reperfusion, infarct size and expansion were not different from those in the permanent occlusion group. The extent of unresorbed necrotic myocardium in areas of infarcted scar was reduced in both early and late reperfusion groups. Infiltration by neutrophilic cells into areas of necrotic myocardium 16 hours after myocardial infarction was increased in both reperfusion groups. Infiltration by macrophages 3 days after infarction was also increased in both reperfusion groups. Late reperfusion, therefore, does not affect infarct expansion, but does contribute to the acceleration of the infarct healing process.     

肢体缺血后处理对兔急性心肌缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨肢体缺血后处理对兔急性心肌缺血再灌注损伤的影响及其可能机制。 方法:健康新西兰大白兔30只，随机分为3组(每组10只)：对照组(Con)、心肌缺血后处理组(MIP)和肢体缺血后处理组(LIP)。缺血前、缺血后及再灌注结束后分别测定血浆磷酸肌酸激酶(CK)活性和丙二醛(MDA)含量；实验结束后，测心肌梗死面积并检测心肌组织髓过氧化物酶(MPO)活性。 结果:MIP和LIP组心肌梗死面积均明显低于Con组(P﹤0.01)；再灌注180 min末血浆CK活性检测证实心肌梗死面积的这种差异；MIP和LIP组再灌注180 min末MDA含量明显低于Con组(P﹤0.01)；MIP和LIP组中性粒细胞在缺血心肌的聚集程度，即组织MPO活性(U/100 g)均明显轻于Con组 (P﹤0.01)。 结论:心肌缺血再灌注前肢体短暂缺血具有显著的心肌保护作用。这种远隔器官缺血后处理心脏保护作用可能与减轻活性氧的损伤及抗氧化作用加强有关。     

鸟氨酸脱羧酶/多胺系统在大鼠缺血预适应心肌保护中的作用

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ODC）/多胺系统在缺血预适应（IPC）心肌保护中的作用。方法:应用离体灌流大鼠心脏复制模拟心肌缺血/再灌注模型。心脏随机分为6组：对照组 (control)、缺血/再灌注组 (IR)、弱缺血预适应组 (IPCw)、强缺血预适应组 (IPCs)、IPCw+多胺抑制剂组 (DF-EG-IPCw)和IPCs+多胺抑制剂组(DF-EG-IPCs)。免疫印迹法定量分析多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶 (ODC)的表达;高效液相色谱测定心肌组织中的多胺（腐胺、精脒、精胺）含量;Powerlab多导生理记录系统记录心脏功能;氯化三苯基四氮唑 (TTC) 染色检测心肌梗死面积;TUNEL方法检测细胞凋亡率,比较其中的差异性。结果:（1）与对照组比,IR组ODC表达下调,腐胺含量增加,精胺含量减少,总多胺池减少（P<0.05）,此时心功能下降（LVDP、HR、CF均低于对照组,P<0.05）,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率增加（P<0.05）;（2）与IR组比,弱及强缺血预处理组（IPCw、IPCs）心肌ODC表达上调,腐胺含量减少,精胺含量增加,总多胺池增加（P<0.05或P<0.01）,此时大鼠心功能有明显改善（LVDP、HR、CF与IR组比,P<0.05）,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率均明显降低（P<0.01）;（3）给予多胺抑制剂后,心肌ODC表达,腐胺、精脒、精胺及总多胺池含量均明显降低（DF-EG-IPCw组 vs IPCw组;DF-EG-IPCs组vs IPCs组,P<0.05或P<0.01）,心功能明显下降（P<0.05）,心肌梗死面积及细胞凋亡率均明显增加（P<0.05）。结论:缺血预适应能明显上调大鼠心肌ODC/多胺系统,减轻缺血/再灌注心肌损伤;多胺合成代谢抑制剂取消了预适应介导的心功能改善、缩小心肌梗死面积及减少心肌细胞凋亡的作用,提示ODC/多胺系统可能参与了缺血预适应介导的心肌保护作用。     

缺血低氧对大鼠心肌产生血管内皮生长因子的影响及其意义

目的:了解缺血低氧刺激与大鼠心肌血管内皮生长因子(VEGF)产生的关系、意义及其可能机制。方法:1.建立Wistar大鼠急性心肌梗塞模型,将28只大鼠随机分为4组,每组7只:A组正常对照;B组急性心肌梗塞1d;C组急性心肌梗塞3d;D组急性心肌梗塞7d。心肌冰冻切片,免疫组化探测VEGF。2.原代培养大鼠心肌细胞随机分组:单纯缺氧组,A:缺氧培养0h;B:缺氧培养6h;C:缺氧培养12h;D:缺氧培养24h;蛋白激酶C(PKC)激动剂波佛酯(PMA)组,A:加入PMA0ng/mL;B:加入PMA10ng/mL;C:加入PMA100ng/mL;D:加入PMA1000ng/mL;均缺氧培养24h;PKC抑制剂chelerythrine(CT)组,A:加入CT0nmol/L;B:加入CT10nmol/L;均缺氧培养24h。免疫组化测定培养心肌细胞中血管内皮生长因子(VEGF),经计算机扫描,图像分析定量。结果:随缺血低氧时间延长,心肌产生VEGF增加,与对照组比较各组均有显著差异,缺血低氧时间与VEGF产生量呈正相关。不同剂量PMA与chelerythrine分别增强及减弱VEGF在缺氧心肌细胞中的表达。结论:缺血低氧强烈刺激心肌产生血管内皮生长因子,缺血心肌通过分泌VEGF对自身具有重要的保护意义。其信号转导途径部分是通过PKC通路实现的。     

参麦注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护效应及其与热休克蛋白的关系

目的 :研究参麦注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护效应以及与热休克蛋白 (HSP70 )的关系。方法 :用在体左冠状动脉前降支穿线结扎法制备心肌缺血再灌注模型。 60只SD大鼠分为三组 ,假手术组n =10只 ,缺血再灌注组n =2 5只 ,参麦注射液干预组n =2 5只。缺血 3 0min ,再灌注 12 0min。观察心肌梗死范围和心肌细胞超微结构变化 ,采用S P免疫组化法 ,检测HSP70 的表达。结果 :参麦注射液干预组与缺血再灌注组相比 ,缺血面积 ( % ) ( 3 8.3 6± 2 .62vs 42 .3 2±2 .2 8,P <0 .0 1) ;梗死面积 ( % ) ( 59.3 6± 2 .44vs 65.63± 1.68,P <0 .0 1)。HSP70 表达 ( 0 .13 8± 0 .0 2 2vs 0 .12 2± 0 .0 18,P <0 .0 1)。电镜下 ,缺血再灌注组 ,肌纤维挛缩 ,核固缩 ,线粒体嵴疏松 ,空泡形成。参麦注射液干预后 ,肌节清晰 ,线粒体嵴较密集 ,无明显空泡形成。结论 :参麦注射液能保护心肌超微结构 ,缩小缺血、梗死范围 ,其机制可能与HSP70 的表达增加有关     

Effects on infarct size and on arrhythmias by controlling reflow after myocardial ischaemia in pigs

Part of the myocardial damage after an ischaemic period might be related to the reperfusion conditions. Many abrupt changes occurring in the heart during reperfusion may add to the damage during the preceding ischaemic period, and increase in infarct size. In this study we tested the hypothesis that infarct size and occurrence of ventricular arrhythmias might be reduced by restricting reflow after an ischaemic period. Seventeen pigs underwent 45 min of total occlusion of the left anterior descending coronary artery with an hydraulic occluder. In the intervention group reperfusion was restricted to 50% of baseline during the first minute, to 100% during the next minute, kept constant for 1 min, and thereafter allowed to increase by 50% of baseline flow every minute until free reflow. In the control group reflow was not restricted. Arrhythmias were recorded. After 2.5 h of reperfusion the heart was excised. Infarct size was measured by using triphenyltetrazolium chloride (delineation of necrosis), fluorescent microspheres (delineation of area at risk) and planimetry. No reduction in infarct size (% of area at risk) was found between the intervention group and the control group (75.9 +/- 5.3% vs. 72.4 +/- 4.3%). The incidence of ventricular arrhythmias and ventricular fibrillation were not found to be different between the groups during reperfusion. Hemodynamic parameters were not significantly different between the two groups. Our data indicate that no substantial protection against myocardial infarct or ventricular arrhythmias could be achieved by controlling reflow using the present protocol after a period of myocardial ischaemia in pigs. Accordingly, our data do not support the notion that control of reflow may be beneficial when treating coronary artery occlusion with percutaneous coronary angioplasty (PCA).