海藻糖用于小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的 探讨海藻糖对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响. 方法 采用12只小鼠控制性超排卵获得的360枚成熟的卵母细胞,分别放入含1.0、0.5、0.3及0 mol/L的海藻糖中孵育3h.部分卵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色;320枚卵母细胞进行玻璃化冷冻和复苏,并进行体外受精,观察卵母细胞成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率. 结果 0.3 mol/L海藻糖组复苏率、受精率与对照组无显著差异(92.59％ vs.90.90％,70.67％ vs.61.43％),但是卵裂率、囊胚形成率均高于对照组(83.02％ vs.44.19％,72.72％ vs.47.37％)(P＜0.001);0.5 mol/L海藻糖组复苏率、受精率、囊胚形成率与对照组无显著差异,但是卵裂率高于对照组(65.22％ vs.44.19％)(P＜0.05);0.3 mol/L海藻糖组囊胚形成率高于0.5 mol/L海藻糖组(72.72％ vs.50.00％)(P＜0.001);1.0 mol/L海藻糖组卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均低于对照组低(P＜0.001). 结论 一定浓度范围的海藻糖对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻有保护作用,0.3 mol/L海藻糖浓度比较适合小鼠卵母细胞玻璃化冷冻.     

过氧化氢对小鼠睾丸支持细胞损伤机制的代谢组学研究

目的:应用基于气相色谱联用质谱(GC-MS)的代谢组学技术研究小鼠睾丸支持细胞氧化应激损伤机制。方法:以过氧化氢(H_2O_2)干预小鼠睾丸支持细胞TM4细胞,建立氧化损伤细胞病理模型。分别采用MTT方法检测存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡率,荧光分光光度计检测细胞内活性氧(ROS)水平;同时通过GCMS检测H_2O_2干预后各组细胞内源性代谢物的指纹图谱。结果:成功建立H_2O_2损伤模型,600μmol/L H_2O_2干预2 h后细胞存活率降至50%左右;低(100μmol/L)、中(300μmol/L)和高(600μmol/L)H_2O_2剂量组总凋亡率分别为(19.45±0.53)%、(20.12±0.58)%和(37.13±0.35)%,均显著高于不加H_2O_2的空白对照组[(10.28±0.35)%,P均0.05];中、高H_2O_2剂量组ROS水平[(1.27±0.10)%、(2.07±0.09)%]也显著高于对照组[(1.00±0.08)%,P0.05、P0.01];代谢组学结果显示:与对照组相比,高剂量组细胞内氨基酸类、糖类等代谢水平均出现明显变化,其中缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、阿拉伯糖、果糖、5-羟色胺和胆固醇等在内的15种代谢物差异显著(VIP1,P0.05)。结论:睾丸支持细胞在H_2O_2干预后产生的损伤或凋亡与细胞内的氨基酸代谢、糖代谢和能量代谢密切相关。     

外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞体外成熟中的应用研究

目的通过在体外成熟（IVM）培养基中加入褪黑素,探索外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞IVM中的作用,以期优化人类未成熟卵母细胞IVM的培养体系。方法在人类未成熟卵母细胞IVM培养体系中添加不同浓度的褪黑素,以排出第一极体作为判断其核成熟的标准,比较不同浓度下的核成熟率。结果与对照组（褪黑素0mol／L）相比,外源性褪黑素在10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率有提高,但只有褪黑素在10^-9mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率呈显著性提高（63．6％VS．40．9％,87．7VS．54．2％,68．2％VS．45．5％,90．4VS．69．4％）（P〈0．05）;当外源性褪黑素浓度增加到10。mol／L和10。mol／L时,人类未成熟卵母细胞的核成熟率显示稍低于对照组,差异无统计学意义（P〉0.05）,但与10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L组相比则呈显著性降低（P〈0．05）。结论外源性褪黑素在适当浓度时可以促进人类未成熟卵母细胞的核成熟,而在浓度超出一定范围时,则可能对卵母细胞的核成熟造成负面影响。     

褪黑素对人卵裂期胚胎发育的影响及机制研究

目的探讨褪黑素对人第3天(D3)卵裂期胚胎发育成囊胚的影响及其作用机制。方法收集2012年10月至2014年10月在本中心行IVF-ET助孕治疗患者捐赠的D3玻璃化冷冻胚胎,复苏后存活率100%且未发生卵裂球溶解的胚胎纳入研究(n=143),随机分为褪黑素组(培养液中加入1×10-7 mol/L褪黑素,n=71)和对照组(不添加褪黑素,n=72)。两组胚胎均放于37℃、5%CO2培养箱中培养72h,统计囊胚及优质囊胚形成率;采用鲁米诺化学发光法检测培养液中总活性氧(ROS)水平;实时荧光定量PCR法分析抗氧化酶类基因CAT、GPx、SOD1、SOD2及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达。结果褪黑素组的囊胚形成率(42.25%)显著高于对照组(26.38%)(P0.05),优质囊胚形成率(30.00%)略高于对照组(26.32%),但无显著性差异(P0.05)。培养72h后两组胚胎培养液中的ROS水平比较(513.33vs.556.67RLUs)无显著性差异(P0.05)。褪黑素处理后,胚胎内过氧化氢酶基因CAT的相对表达量(1.68±0.43)较对照组(1.00±0.03)显著上调(P0.05),其他基因包括Bax、Bcl-2、SOD1、SOD2、GPx的表达则没有显著性差异(P0.05)。结论褪黑素能够促进人卵裂期胚胎继续发育形成囊胚,其机制可能与上调胚胎中过氧化氢酶基因CAT的表达有关。     

益肾方对大鼠肾小管上皮细胞氧化应激的保护作用及其机制研究

目的:探究益肾方对NRK-52E细胞氧化损伤的保护作用。方法:建立H_2O_2诱导NRK-52E氧化损伤模型,分为正常对照组,H_2O_2模型组,益肾方组。流式细胞术测定细胞凋亡率,运用Western-blot技术检测Caspase-3和BCL-2的蛋白表达。结果:与正常对照组比较,H_2O_2造模组的细胞凋亡率明显增高(P 0. 01);与H_2O_2模型组比较,益肾方组在益肾方浓度100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时,细胞的凋亡率出现明显的下降(P 0. 05)。与H_2O_2模型组相比,益肾方组在益肾方浓度100μg/ml、200μg/ml时,Caspase-3的蛋白表达明显降低,BCL-2的蛋白表达增加(P 0. 05)。结论:益肾方对NRK-52E细胞氧化损伤的保护机制,可能与其降低细胞凋亡,同时下调Caspase-3和上调BCL-2的蛋白表达有关。     

毛蕊异黄酮对PI3K/Akt信号通路与PC-3细胞凋亡的作用

目的 探究毛蕊异黄酮促进前列腺癌细胞PC-3凋亡的机制.方法 选取0、25、50、100、200μmol/L的毛蕊异黄酮(Calycosin)处理PC-3细胞,并设置溶剂对照(DMSO,二甲基亚砜)组,采用MTT法检测48h后细胞增殖情况;流式细胞术检测0、25、50、100、200 μmol/L48h后细胞凋亡率;Western Blot法检测0μmoL/L组、200μmol/L毛蕊异黄酮组、200μmol/L毛蕊异黄酮+ PI3K特异性抑制剂(Wortmannin)共处理组细胞的Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平.结果 MTT实验显示毛蕊异黄酮能够抑制PC-3细胞的增殖,且呈现剂量依赖性(P＜0.05);流式细胞实验显示,0、25、50、100、200μmol/L浓度水平的毛蕊异黄酮处理PC-3细胞48h后的凋亡率分别为(0.1±0.04)％、(6.8±0.6)％、(9.2±0.2)％、(11.5±0.27)％、(59.2±0.36)％(P ＜0.05);Western blot法显示,与0μmol/L组相比,200μmol/L毛蕊异黄酮组p-Akt、Bcl-2表达水平下降(P＜0.05),加入Wortmannin后,二者水平再次下降;与0μmol/L组相比,200μmol/L毛蕊异黄酮组Bax、Caspsse-3表达水平增加(P＜0.05),加入Wortmannin后,二者水平再次增加.结论 毛蕊异黄酮可抑制PC-3细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制是下调PI3K/Akt信号通路,启动线粒体诱导的凋亡途径.     

线粒体氧化磷酸化抑制剂FCCP体外对人精子动力学和线粒体功能的影响

目的通过线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)特异性抑制剂FCCP对人精子活动力及其线粒体功能影响的研究,探讨氧化磷酸化在精子能量代谢中的作用。方法选择来自捐精志愿者的正常精液8份,优选后制备精子悬液,将每份精子悬液分为4组,分别与终浓度为0μmol/L(对照组)、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的FCCP共孵育1h、3h、5h,以精子动力学参数、线粒体膜电位、精子细胞内ATP含量、精子质膜完整性作为评价指标,分析比较各组间的差异。结果 (1)各组精子活动率和其他各项运动参数随着FCCP浓度增高呈下降趋势:孵育1h后,与对照组相比,仅10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率和精子头侧摆幅度(ALH)显著下降(P0.05),其余指标无显著性变化,而其余浓度处理组的各指标变化均无统计学意义(P0.05);孵育3h后,10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率、平均路径速率(VAP)、直线速率(VSL)、曲线速率(VCL)、ALH和鞭打频率(BCF)均显著降低(P0.05),5μmol/L组的ALH和BCF指标显著下降(P0.05);孵育5h后,与对照组相比,10μmol/L组的前述指标继续显著性下降(P0.05),5μmol/L组的精子活动率和前向运动百分率也出现显著降低(P0.05),而2.5μmol/L组各指标差异均无统计学意义(P0.05)。(2)精子线粒体膜电位(MMP)和ATP含量随FCCP浓度增加逐渐降低,10μmol/L组的MMP和ATP含量显著低于对照组(P0.05)。(3)质膜完整性比较中,10μmol/L组比对照组显著降低(73.94%vs.84.53%)(P0.05)。(4)随着FCCP孵育时间延长,各组精子活动率和前向运动百分率呈下降趋势。结论不同浓度的FCCP体外处理精子后,精子活动率和其他各项运动参数,以及反映线粒体活性的线粒体膜电位和ATP含量呈浓度依赖性下降,FCCP所抑制的线粒体氧化磷酸化是精子能量代谢的重要途径。     

化学激活在小鼠圆形精子细胞体外受精中的应用

目的:通过对生精细胞体外培养所获圆形精子细胞显微注射(ROSI)后的小鼠卵母细胞进行单一和联合化学激活,寻找小鼠圆形精子细胞体外受精的最佳激活方案。方法:采用不同浓度的乙醇(EH)、离子霉素(Ion)、钙离子载体A23187(CIA)、氯化锶(SrCl2)、6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)及放线菌酮(CHX)对ROSI后的卵母细胞进行不同作用时间的激活,并根据不同的激活途径,联合两种最佳激活浓度和时间的激活剂对ROSI后的卵母细胞行联合激活,以受精率、卵裂率和桑囊胚形成率为观察指标,比较单一及联合方案对卵母细胞的激活效果。结果:①单一激活时,各激活剂的最佳方案分别为7%EH作用6 min,5μmol/L CIA作用5 min,5μmol/L Ion作用5 min,2 mmol/L 6-DMAP作用2 h,10 mmol/L SrCl2作用1.5 h,10μg/ml CHX作用1.5 h,其中10 mmol/L SrCl2作用1.5 h桑囊胚率最高,显著优于CHX方案(P0.05),但与其它各组无显著性差异;②EH+6-DMAP组桑囊胚率(29.63%)显著高于其它联合激活组以及除SrCl2以外所有单一激活方案(P0.05),且正常受精率、卵裂率及桑囊胚率均高于SrCl2组,但无显著性差异。结论:单一激活方案中10 mmol/L SrCl2作用1.5 h,联合方案中7%EH作用6 min+2 mmol/L 6-DMAP作用2 h对体外培养所获圆形精子细胞ROSI后的卵母细胞激活效果最佳。EH+6-DMAP的联合激活方案优于单一激活。     

蛋白激酶C-环磷酸腺苷信号通路在三氧化二砷诱导膀胱癌凋亡中的作用

目的探讨三氧化二砷(As_2O_3)诱导膀胱癌凋亡过程中蛋白激酶C(PKC)和环磷酸腺苷(cAMP)水平的改变及其在膀胱癌凋亡中的作用。方法应用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、放射免疫、酶联免疫、免疫组化和Western blot等方法分别检测As_2O_3作用后膀胱癌T24细胞凋亡、凋亡过程中PKC和cAMP改变、caspase 3蛋白表达及caspase 3激活。结果药物作用24 h后,凋亡细胞呈现棕黄色浓染和绿色荧光。对照组细胞凋亡率0.86%,PKC总量2.55pmol·min~(-1)·μg~(-1),cAMP含量22.56pmol/ml,caspase 3蛋白表达率8.01%。与对照组相比,5μmol/L和10μmol/L As_2O_3组细胞凋亡率分别升高8.51倍和13.33倍,PKC总量分别降低59.22%和64.71%,cAMP含量分别升高5.34倍和4.23倍,caspase 3蛋白表达率分别上调3.96倍和6.76倍,差异有统计学意义(P＜0.05)。与As_2O_3组相比,5μmol/L和10μmol/L As_2O_3+100nmol/L PKC激动剂佛波酯(PMA)组细胞凋亡率分别降低40.22%和45.58%,PKC总量分别升高1.00倍和0.76倍,cAMP含量分别降低8.37%和31.46%,caspase 3蛋白表达率分别下调51.09%和65.03%。As_2O_3组均可显著激活caspase 3活性,As_2O_3+100nmol/L PMA组对caspase 3激活明显弱于同浓度As_2O_3组。结论As_2O_3可通过降低PKC和升高cAMP水平启动膀胱癌T24细胞凋亡,诱导细胞凋亡。     

抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的 研究抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响,为进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据. 方法 对照组采用基础体外培养液,共培养101枚GV期小鼠卵母细胞;实验组采用基础体外培养液+0.6 mmol/L半胱氨酸,共培养115枚GV期小鼠卵母细胞.观察两组卵母细胞的成熟率、谷胱甘肽的含量和线粒体内膜电位. 结果 对照组和实验组卵母细胞的成熟率分别为68.3％和80.0％,差别具有统计学意义(P＜0.05)；对照组和实验组卵母细胞平均谷胱甘肽含量分别为0.48±0.6 μg/L和0.51±0.5 μg/L,实验组谷胱甘肽含量略高,但两者无统计学差异(P＞0.05).线粒体内膜电位,对照组与实验组分别为0.04±0.003 △Ψm与0.39±0.020△Ψm,实验组线粒体内膜电位明显高于对照组(P＜0.05). 结论 抗氧化剂半胱氨酸对体外培养小鼠卵母细胞成熟有一定的促进作用,并可能会提高卵母细胞的发育潜能.     

姜黄素保护大鼠肾小管上皮细胞对抗氧化应激引起的损伤作用

目的 探讨姜黄素对氧化应激诱导大鼠近端肾小管上皮细胞 (NRK-52E) 损伤作用的影响。 方法 用不同浓度的H2O2处理NRK-52E细胞,建立氧化应激损伤NRK-52E的实验模型。应用Hoechst 33258染色法观察凋亡细胞的形态学改变;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测Bcl-2蛋白的表达。 结果 H2O2在100~500 μmol/L浓度范围内处理NRK-52E细胞24 h,呈浓度依赖性地增加细胞的凋亡率;500 μmol/L H2O2能显著抑制NRK-52E细胞Bcl-2的表达（P < 0.05）。20 μmol/L和40 μmol/L姜黄素能显著阻断H2O2对NRK-52E细胞的致凋亡作用[（32.9±8.1）%、（22.23±9.3）%比（72.7±10.5）%,均P < 0.05],并能显著拮抗H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用（P < 0.05）。40 μmol/L姜黄素本身也能上调Bcl-2蛋白的表达（P < 0.05）。 结论 姜黄素能保护NRK-52E细胞对抗氧化应激引起的细胞凋亡,此肾小管上皮细胞保护作用可能与其抑制H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用有关。     

肾动脉狭窄80例外科治疗

目的 探讨肾动脉狭窄外科治疗方法的选择和疗效.方法 回顾性分析1997年11月到2008年8月80例肾动脉狭窄患者的外科治疗经验.男性53例,女性27例,年龄9～80岁.病变包括动脉硬化42例,大动脉炎23例,肌纤维发育不良11例.共接受外科治疗83人次,其中腹主动脉肾动脉旁路术13例,自体肾移植术5例,肾切除术1例,肾动脉内膜切除术1例,肾动脉狭窄段切除吻合术1例,球囊扩张术14例,支架成形术48例.结果 围手术期死亡1例.63例获得随访,随访时间1～129个月,2例死亡.随访患者血压(135.7±15.8)/(80.1±8.5)mm Hg(1 mm Hg=0.133kPa),较术前(149.8±18.3)/(88±13.6)mm Hg下降(P<0.01).总的降压有效率为65.6%,动脉硬化、大动脉炎、肌纤维发育不良患者的降压有效率分别为50%、73.3%和100%(P<0.05).随访患者肌酐(112.7±53.6)/μmol/L,低于术前(131.7±91.7)μmol/L(P<0.05).结论 肾动脉狭窄通过外科治疗可以有效改善血压和肾功能,动脉硬化病变首选支架成形,肌纤维发育不良性病变首选球囊扩张,大动脉炎性病变首选手术治疗.     

心脏移植患者服用微乳化环孢素A后的血药浓度C2值监测及意义

目的 评估心脏移植患者口服微乳化环孢素A(CsA)后2 h时的血药浓度(C2)作为临床监测指标的安全性和准确性.方法 107例心脏移植受者,除29例研究阶段移植的患者外,其余为定期随访患者.心脏移植术后口服微乳化CsA(以下"CsA"均指微乳化CsA)预防排斥反应,其中54例以服用CsA前即刻血药浓度(C0)为监测指标(C0组),另53例以C2为监测指标(C2组),所有患者入组时血肌酐(Cr)<150 tmaol/L,丙氨酸转氨酶(ALT)<80 U/L.在测定血药浓度的同时,检查心脏及肝、肾功能.结果 C0组和C2组肝损害发生率分别为25.0%(13/52)和10.0%(5/50);肾损害发生率分别为5.8%(3/52)和8.0%(4/50);急性排斥反应发生率分别为11.5%(6/52)和6.0%(3/50).C0组中,未发生排斥反应者的C2为(0.131±0.074)μmol/L,低于发生排斥反应者的(0.133±0.078)μmol/L,但二者间的差异无统计学意义(P0.05);发生不良反应(肝、肾毒性)者的C0为(0.133±0.075)μmol/L,无不良反应者的C0为(0.131±0.073)tanol/L,二者间的差异无统计学意义(P0.05).C2组中,未发生排斥反应者的C2为(0.659±0.296)μmol/L,高于发生排斥反应者的(0.516±0.217)μmol/L(P<0.05);发生不良反应者的C2为(0.719±0.288)μmol/L,无不良反应者的C2为(0.579±0.271)tanol/L,后者明显低于前者(P<0.05).结论在提示急性排斥反应和CsA所致不良反应的准确性方面,C2均明显优于C0.     

白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭的影响

目的 探讨白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭能力的影响.方法 实验分为空白对照组,0.1%DMSO组,白藜芦醇组(50、100、200 μmol/L).MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化;Transwell侵袭小室检测白藜芦醇对细胞侵袭的影响;荧光实时定量PCR和Western blot检测白藜芦醇对细胞Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达的影响.数据以-x±s表示,多组比较采用方差分析.结果 (1)空白对照组抑制率为0;0.1%DMSO组细胞抑制率为3.25%±0.42%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞抑制率为13.23%±1.68%;白藜芦醇100μmol/L组细胞抑制率为42.25%±3.20%;白藜芦醇200μmol/L组细胞抑制率为56.94%±5.31%.各组比较,差异有统计学意义(F=460.10,P<0.05).(2)空白对照组细胞凋亡率为0.05%±0.03%;0.1%DMSO组细胞为凋亡率为3.39%±1.77%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞凋亡率为6.92%±1.85%;白藜芦醇100 μmol/L组细胞凋亡率为19.05%±2.01%;白藜芦醇200 μmol/L组细胞凋亡率为27.17%±6.43%.各组比较,差异有统计学意义(F=38.84,P<0.05).(3)0.1%DMSO组对细胞周期无显著影响.白藜芦醇引起PANC-1细胞G0/G1期和S期阻滞,G2/M期细胞减少.(4)空白对照组平均穿膜细胞数为61±13;0.1%DMSO组为54±13;白藜芦醇50 μmol/L组为48±15;白藜芦醇100 μmol/L组为23±6;白藜芦醇200 μmol/L组为18±7.各组比较,差异有统计学意义(F=69.08,P<0.05).(5)白藜芦醇可使PANC-1细胞Bax表达升高,Bcl-2表达下调.MMP-2、MMP-9的表达明显受到抑制,mRNA和蛋白水平变化一致.结论 白藜芦醇可明显抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制其侵袭能力.     

罗格列酮对高糖环境中大鼠系膜细胞活性氧及单核细胞化学吸引蛋白质1的抑制作用

目的 观察罗格列酮对高糖培养基中大鼠系膜细胞活性氧（ROS）及单核细胞化学吸引蛋白质1（MCP-1）mRNA、蛋白表达的抑制作用,并探讨相关机制。 方法 将培养的大鼠系膜细胞分为以下6组：对照组（C组,普通MEM培养基,含5.6 mmol/L葡萄糖）、甘露醇组（M组,24.2 mmol/L甘露醇＋C组）、高糖组（H组,30 mmol/L高糖MEM培养基）、小剂量罗格列酮干预组（R1组,H组＋10 μmol/L罗格列酮）、大剂量罗格列酮干预组（R2组,H组＋20 μmol/L罗格列酮）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预组（N组,H组＋5 mmol/L NAC）。采用激光共聚焦法检测ROS水平,分别采用RT-PCR和ELISA法检测MCP-1 mRNA及蛋白含量。 结果 C组和M组间ROS、MCP-1的表达差异无统计学意义,H组ROS水平较C组增高4.1倍（P < 0.01）,分别采用罗格列酮（20 μmol/L）和NAC干预后,ROS水平显著降低（P < 0.01）;罗格列酮（20 μmol/L）和NAC均可显著抑制高糖环境中MCP-1 mRNA的高表达（P < 0.01）。H组中MCP-1蛋白水平[（940.9±20.3） ng/L]显著高于C组[（403.0±8.1） ng/L]（P < 0.01）,而R2组和N组的MCP-1蛋白水平[（562.5±15.3） ng/L,（539.8±8.3） ng/L]显著低于H组（P < 0.01）。 结论 罗格列酮可通过减少ROS而降低高糖所诱导的MCP-1表达,而这可能是罗格列酮发挥直接肾脏保护作用的机制之一。     

吲哚胺2,3双加氧酶对小鼠CD4+T细胞增殖的抑制作用

目的 探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞增殖的机制。方法 通过低色氨酸(10μmol/L)培养基(LTM)和/或添加不同浓度(50、100、200和400μmol/L)色氨酸代谢产物(TC),观察小鼠树突细胞(DC)与异系CD4+T细胞培养体系中后者的增殖。Annexin-V及碘化丙锭(PI)双染法测定CD4+T细胞凋亡。结果 LTM中CD4+T细胞增殖指数(2.718 ±0.010)及抑制CD4+T细胞增殖的TC浓度(200μmol/L KYN或50 μmol/L 3-HAA)较正常色氨酸培养基(NTM)(3.385 ±0.013,400 μmol/L KYN或100 μmol/L 3-HAA)显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。LTM中CD4+T细胞早期凋亡率(33.163±0.556)％显著高于NTM(8.867 ±0.565)％ (P ＜0.01)。NTM中CD4+T细胞凋亡率随3-HAA浓度升高而增加[3-HAA浓度50、100、200和400 μmol/L组中分别为(14.433 ±0.640)％、(22.273±0.629)％、(37.363±0.953)％和(46.643±0.633)％]。结论 LTM及TC均可通过诱导凋亡来抑制CD4+T细胞增殖,两者具有叠加效应。     

基于多肽阵列技术构建穿膜肽靶向抑制Fyn与突触后致密物蛋白95相互作用的实验研究

目的 探讨基于多肽阵列技术合成的穿膜肽离体条件下抑制非受体酪氨酸激酶Fyn与突触后致密物蛋白(postsynaptic density protein,PSD)95相互作用,进而抑制含N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl D-aspartate receptor subtype 2B,NR2B)的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl D-aspartate receptor,NMDAR)过度磷酸化,减轻慢性疼痛的可行性.方法 ①通过多肽阵列技术的ovedapping平台确定Fyn的SH2结构域与PSD95的PDZ3结构域相互作用的结合基序,合成含此结合基序的短肽FynP,并与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)-Tat蛋白转导结构域连接形成可进入细胞的穿膜肽FynP-Tat,同时合成乱序穿膜肽mFynP-Tat.②原代培养SD大鼠胎鼠脊髓背角神经元,通过免疫荧光检测不同浓度组(10、20、30 μmol/L)多肽内化细胞的效率.③用CCK8法检测不同浓度(10、20、100μmol/L)穿膜肽分别孵育神经细胞(6、24、48 h)的细胞毒性.④将神经细胞分为穿膜肽组(FynP-Tat组)、乱序穿膜肽组(mFynP-Tat组)和PBS组(对照组)进行孵育,用谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST) pull-down和Western blot验证抑制Fyn与PSD95相互作用的效率. 结果 ①通过overlapping确定Fyn与PSD95相互作用的结合基序为KGAYSL.②与FynP-Tat 10 μmol/L组[(77.3±1.4)％]比较,FynP-Tat 20 μmol/L组[(91.5±2.0)％]和FynP-Tat 30 μmol/L组[(93.4:2.2)％]的内化效率较高,差异有统计学意义(P＜0.05);与mFynP-Tat 10μmol/L组[(75.0±3.6)％]比较,mFynP-Tat 20 μmol/L组[(91.4±1.3)％]和mFynP-Tat 30 μmol/L组[(92.7±2.1)％]的内化效率较高,差异有统计学意义(P＜0.05);③与FynP-Tat(100 μmol/L,6h)组[(82.5±3.0)％]比较,FynP-Tat(100 μmol/L,24 h)组和FynP-Tat(100 μmol/L,48 h)组细胞活力[(75.1±1.5)％和(68.5±1.2)％]降低(P＜0.05);与mFynP-Tat(100 μmol/L,6h)组[(83.3±2.0)％]比较,mFynP-Tat(100 μ mol/L,24 h)组和mFynP-Tat(100 μmol/L,48 h)组细胞活力[(75.6±2.9)％和(68.1±0.7)％]降低(P＜0.05);④与mFynP-Tat组、PBS组比较结果显示,FynP-Tat能够抑制PSD95结合到GST-Fyn融合蛋白上(P＜0.05),但不会抑制PSD95结合到GST-NR2B融合蛋白上(P＞0.05). 结论 离体条件下,基于多肽阵列技术合成的穿膜肽FynP-Tat能够进入神经细胞,细胞毒性低,可有效抑制Fyn与PSD95的相互作用.     

罗格列酮通过核因子κB抑制脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞CD40和胞间黏附分子1的表达

目的 探讨罗格列酮对脂多糖（LPS）诱导的体外培养大鼠腹膜间皮细胞CD40和胞间黏附分子1（ICAM-1）表达的影响以及调节机制。 方法 分离及培养大鼠原代腹膜间皮细胞。将细胞随机分为正常对照组、LPS（5 mg/L）组、BAY11-7085（NF-κB抑制剂）组（5 μmol/L预刺激3 h后加入LPS作用3 h）、不同浓度罗格列酮（过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ配体）组（10、20 μmol/L分别预处理3 h再加入LPS 5 mg/L）、GW9662（过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ拮抗剂）预处理组（预处理3 h后加入罗格列酮10 μmol/L,3 h后再加入LPS 5 mg/L）和溶媒对照组。加入LPS后 1 h收集细胞检测核因子κB（NF-κB） p65水平;3 h收集细胞分别检测CD40和ICAM-1基因表达;24 h收集细胞分别检测CD40和ICAM-1蛋白表达。RT-PCR法检测基因表达;Western印迹和免疫荧光方法检测蛋白表达及核因子磷酸化。 结果 （1）常规培养的腹膜间皮细胞表达基础量CD40和ICAM-1,LPS显著上调其表达（P < 0.05）;LPS作用1 h时腹膜间皮细胞磷酸化NF-κB p65活化水平显著增高,与对照组差异有统计学意义 (1.10±0.17比0.55±0.06,P < 0.05)。（2）NF-κB抑制剂BAY11-7085预处理后LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平、CD40 和ICAM-1表达显著低于LPS组（0.22±0.11比1.10±0.17,P < 0.01;0.34±0.02 比 0.50±0.06,P < 0.05;0.35±0.16 比0.74±0.03,P < 0.05）。（3）罗格列酮预处理后,LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平、CD40以及ICAM-1蛋白表达亦显著低于LPS组（0.77±0.08比0.90±0.10,P < 0.01;0.79±0.16 比0.99±0.06,P < 0.05;0.83±0.20比1.22±0.13,P < 0.05）。GW9662和罗格列酮联合预处理后,LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平与罗格列酮预处理组差异无统计学意义,但CD40和ICAM-1表达显著高于罗格列酮预处理组（0.95±0.19比0.79±0.16;1.04±0.24比0.83±0.20,均P < 0.05）。 结论 NF-κB信号通路参与调节LPS诱导的腹膜间皮细胞表达CD40和ICAM-1。罗格列酮通过 NF-κB途径下调CD40和ICAM-1表达,从而发挥抗炎作用。     

雷公藤甲素对IgA肾病患者外周血单个核细胞炎性反应及凋亡的影响

目的 探讨IgA肾病(IgAN)患者外周血单个核细胞（PBMC）炎性因子分泌及自身凋亡状态,以及雷公藤甲素(TP) 对其调节的相关机制。 方法 取IgAN患者（n=29）及健康人（n=16）外周血,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和硝酸还原酶法（Griess法）检测血浆肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和一氧化氮(NO)表达情况。体外培养IgAN患者PBMC,以不同浓度TP刺激PMBC,四唑盐比色间接法（MTT）检测TP对细胞生长的抑制效应。根据MTT结果,分别分为IgAN患者PBMC组、植物血球凝集素（PHA,10 mg/L,促细胞分裂原）模型组和PHA（10 mg/L）+TP（12.5 μg/L、25 μg/L）处理组。ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6的分泌情况;Griess法检测上清液中NO含量;流式细胞仪分析细胞凋亡率;RT-PCR法、Western印迹法检测PBMC中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱天冬蛋白酶（caspase）-9、caspase-3基因和蛋白表达变化。 结果 IgAN患者血浆TNF-α[（131.57±50.61） ng/L比（30.24±18.93） ng/L,P < 0.01],IL-6[（76.36±25.21） ng/L比（35.08±16.59） ng/L,P < 0.01]和NO[（46.36±12.93） μmol/L比（26.61±10.87） μmol/L,P < 0.01]均显著高于健康人,PBMC凋亡率亦显著高于健康人[（16.88±5.66）%比（8.67±3.87）%,P < 0.01]。TP可抑制IgAN患者PBMC分泌 TNF-α、IL-6 和NO,诱导其凋亡;也可抑制Bcl-2表达,增加Bax、caspase-9、caspase-3表达。 结论 IgAN患者体内PBMC处于高度活化状态,并且凋亡率增高。TP能有效抑制IgAN患者PBMC的炎性活化状态,并可能通过线粒体途径改变Bcl-2蛋白家族抗凋亡因子和促凋亡因子平衡而诱导IgAN患者PBMC凋亡。