人颗粒酶A活性段的表达、纯化及其活性鉴定

目的:克隆和表达人颗粒酶A(Granzyme A,Gzm A)基因的活性片段(active Granzyme A,a Gzm A)并进行活性鉴定。方法:以全长人Gzm A基因为模板,PCR扩增a Gzm A基因片段,限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后插入原核表达载体p ET24a(+),将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组蛋白用镍层析柱亲和层析进行纯化后,利用BLT底物溶液进行活性鉴定。结果:PCR扩增得到长约700 bp的基因片段。重组质粒p ET24a-a Gzm A经酶切和测序证实a Gzm A基因序列正确插入载体质粒中。SDS-PAGE显示在26 k D处有一特异性蛋白条带。Western blot证实该蛋白可与小鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合。利用镍柱亲和层析法可从包涵体中纯化得到纯度较高的重组蛋白,且具有较好的酶活性。结论:成功制备了具有生物学活性的人颗粒酶A重组蛋白。     

肾癌相关抗原G250的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 构建原核表达质粒pET-42a-hG250,表达并纯化肾癌相关抗原G250融合蛋白,并检测G250融合蛋白的抗原活性.方法 利用PCR从pGEM-T-G250质粒中扩增G250基因片段(112～1242 bp),测序正确后将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-hG250.将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导G250蛋白的原核表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,Western blot法检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA对其抗原活性进行评价.结果 酶切和测序结果证实pET-42a-hG250原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的G250融合蛋白;Western b1ot法和ELISA检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应,显示纯化后的G250融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功构建了肾癌相关抗原G250基因的原核表达载体,纯化获得了G250融合蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性.     

MAGE-3抗原冲击外周血单个核细胞诱导抗肿瘤免疫应答

MAGE 3基因的表达产物是一种肿瘤排斥抗原 ,在抗肿瘤免疫治疗中可作为靶抗原。本实验以原核表达GST MAGE 3融合蛋白 ,体外观察MAGE 3蛋白抗原冲击外周血单个核细胞 (Pe ripharalbloodmononuclearcells,PBMCs) ,能否诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。根据MAGE 3cDNA序列 ,设计引物 ,通过RT PCR从胎盘组织中扩增MAGE 3全部编码序列 ,片段长度 95 7bp ,将该片段克隆至pGEX 4T 2原核表达载体。重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经IPTG诱导表达 ,表达产物经电泳证实后再用GlutathioneSepharose 4B纯化 ,蛋白纯度在 90 %以上。纯化的蛋…     

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素（MBL）糖识别域（CRD）。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEM-mbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Western blot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX-4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1-CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GST-CRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GST-CRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBL CRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

人蔗糖酶蛋白在大肠杆菌的诱导表达与纯化

目的构建人蔗糖酶(h SUC)基因原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白。方法采用反转录PCR法扩增得到h SUC基因片段,并将其克隆到表达载体p ET-28a(+)中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中表达,采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果克隆得到1482 bp目的基因,酶切和测序证实h SUC基因片段成功插入到p ET-28a(+)表达载体。表达的融合蛋白质相对分子质量(Mr)为61 240,Western blot结果显示融合蛋白可以与h SUC抗体特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达和纯化h SUC融合蛋白。     

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。     

抗膀胱癌重组免疫毒素的可溶性表达及其抗肿瘤活性

目的 :构建抗膀胱癌重组免疫毒素BDI 1 PE38/KDEL的可溶性表达载体 ,并表达、纯化具有抗肿瘤活性的可溶性蛋白。方法 :将抗膀胱癌重组免疫毒素BDI 1 PE38/KDEL的基因片段 ,插入含有大肠杆菌脯氨酰顺反异构酶FkpA基因的共表达载体pTMFK中 ,构建重组共表达载体pTMFK IT。以重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) Star,共表达目的蛋白与FkpA。表达产物以镍离子金属螯合层析柱及抗PE抗体亲和柱层析进行纯化。用ELISA检测免疫毒素的抗原结合活性 ,用噻唑蓝(MTT)法进行体外细胞杀伤实验。结果 :成功地构建了抗膀胱癌免疫毒素基因与FkpA基因的共表达载体 ,并获得纯度较高的目的表达产物。纯化后的表达产物与BIU 87膀胱癌细胞膜抗原具有良好的特异性结合活性 ,对BIU 87膀胱癌细胞有明显的体外特异性杀伤作用。结论 :获得了对膀胱癌细胞具有显著特异性杀伤活性的免疫毒素 ,为将其进一步应用于膀胱癌的靶向治疗研究奠定了基础     

犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用

目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。     

HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化

探索进一步提高ＨＩＶ－１Ｐ２４ｇａｇ蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段。方法：通过改造原核表达载体ＰＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５,将ＨＩＶ－１ｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列,插入到ｐＶＶ５ｂ和ｐＥＴ２８ｂ的相应位点中,构建了重组表达质粒,ｐＥＧ１ｂ和ｐＥＧ７ｂ,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用ＩＭＡＣ金属螯合层析柱进行纯经,纯化的表达产物用     

输血传播病毒部分基因的克隆表达及表达产物活性 …

目的 构建含输血传播病毒（ＴＴＶ）部分基因序列的原核表达载体并进行表达及产物活性的鉴定。方法 在计算机模拟基础上,采用ＰＣＲ的方法,从一名非甲－庚肝炎患者血清中,扩增编码蛋白具有抗原活性的ＴＴＶＯＲＦ２部分基因片段。将片段插入表达载体ｐＱＥ－３０,在大肠埃希菌中进行表达并利用酶联免疫吸附试验９ＥＬＩＳＡ）鉴定表达产物活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后经电脑分析显示,表达产物相对分子质量与预计相同,     

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。     

原核表达和制备EB 病毒GST/BFRF3融合蛋白用于鼻咽癌的诊断筛查

 目的：构建表达EB病毒衣壳抗原BFRF3基因的原核细胞表达载体并探讨其在鼻咽癌血清学诊断中的应用。方法：以EB病毒 DNA为模版,采用PCR法扩增目的基因BFRF3,与原核表达载体PGEX-5X-1连接,构建PGEX-5X- BFRF3重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达GST/BFRF3融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定后,纯化目的蛋白作为包被抗原,制备ELISA试剂检测鼻咽癌患者和正常人群BFRF3-IgA抗体。结果：在大肠杆菌中成功地表达了GST/BFRF3融合蛋白,相对分子质量为44 kD,免疫印迹证实目的蛋白带有免疫原性,目的蛋白经纯化后作为包被抗原检测鼻咽癌患者的灵敏度和特异度分别为65％和87％。结论：采用原核表达系统成功构建并表达了GST/BFRF3融合蛋白,其在鼻咽癌血清筛选中具有诊断价值。     

小鼠PGRP-L分子N端基因片段的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠肝组织总RNA中扩增到长约500bp的小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)分子N端基因片段,将其克隆入pUCm-T载体构建重组质粒pmGN,DNA测序表明该基因片段长530bp,序列与GenBank中的完全一致。应用PCR技术,从重组质粒pmGN中扩增目的基因片段,插入表达质粒pET-28a构建重组表达载体pET-GN,导入大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTAagarose层析柱纯化。SDS-PAGE和Westernblot分析发现,表达产物主要以包涵体形式存在,相对分子质量约29000。ELISA表明,重组蛋白能被抗mPGRP-L分子N端单表位多克隆抗体所识别。为mPGRP-L分子的研究奠定了一定基础。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因酵母工程菌的构建及表达条件的优化

目的：构建表达HIV-1gag-gp120嵌合基因的酵母工程菌，并优化表达条件。方法：将gag-gp120嵌合基因插入到酵母表达载体pHILS1中，构建了表达质粒pHILGP。线性化质粒电转化毕赤酵母菌GS115后进行整合，通过PCR及表达产物的SDS-PAGE和ELISA等方法筛选 阳性酵母工程菌，并优化表达条件。结果：成功构建表达融合蛋白的酵母工程菌，表达量为13%左右。表达蛋白能与HIV-1阳性血清发生反应，但其相对分子质量（Mr）比预计计算的值要小。最佳表达条件为：BMMY培养基，85%溶解氧，培养时间3d，1%甲醇诱导浓度。结论：表达的融合蛋白具有很好的抗原特异性，存在于上清中，这有利于目的蛋白的分离纯化。